多囊卵巢综合征痰湿证患者血清差异蛋白质组学研究

高金金，王美玲，葛鹏玲，侯丽辉，李 妍

(1. 山西省中西医结合医院，山西 太原 030013；2. 黑龙江中医药大学中西医结合博士后流动站，黑龙江 哈尔滨 150040；3. 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一种发病多因性，临床表现多态性的内分泌和代谢紊乱综合征，在育龄期女性发病率为15%～20%[1]，其临床特征包括闭经、不孕、卵巢多囊样改变和高雄激素血症。研究显示，有50%～70%的PCOS患者存在胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)[2]，由于PCOS患者内分泌失调导致高雄激素血症和高胰岛素血症相互影响，患者存在发生2型糖尿病、心血管疾病和焦虑抑郁等远期并发症的风险。痰湿证是 PCOS患者的常见证型[3]， PCOS痰湿证患者常伴有肥胖并以IR和高雄激素血症为特点[4]。从生物信息学层面探讨PCOS痰湿证的微观物质基础机制，对PCOS痰湿证患者早期预测、筛查，并提前做出预防非常重要。为研究PCOS痰湿证患者的早期诊断标志物，本研究以蛋白质组学为切入点，采用相对和绝对定量同位素标记技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)联合超高液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)，对PCOS痰湿证患者异常表达蛋白进行生物学分析，探索PCOS痰湿证发病机制的特异血清生物标志物，为临床诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2019年4月—2020年10月于山西省中西医结合医院和黑龙江中医药大学附属第一医院确诊为PCOS痰湿证患者12例，年龄19～45岁，PCOS西医诊断参照2003 年鹿特丹联合修订的诊断标准[5]，PCOS痰湿证诊断标准参照国家临床研究基地单病种PCOS诊疗方案与路径的中医辨证标准和《中药新药临床研究指导原则(试行)》[6]。排除其他原因所致的与PCOS临床和内分泌征象相仿的疾病；近3个月应用过影响内分泌的激素类药物和避孕药者；具有临床意义的消化道系统疾病、呼吸系统疾病、血液系统疾病、泌尿系统疾病、神经系统疾病、精神疾病等严重疾病者。随机另选取同期年龄相近的12例排除PCOS的健康者作为对照组。本研究经黑龙江中医药大学附属第一医院医学伦理委员会审核通过(ZXY2022JY003)。

1.2主要试剂与仪器 iTRAQ试剂盒，二硫素糖醇(DTT)，蛋白酶抑制剂，BCA蛋白定量试剂盒，测序级胰蛋白(Trypsin)。NanoAcuity超高压纳升级液相色谱；Q Exative HF质谱仪；高pH反相色谱柱Acquity UPLC®BEH C18 1.7 μm, 2.1×50 mm；sep-Pak C18除盐柱1 cc(100 mg)；纳升级肽段分析柱Acclaim PepMap C18, 75 μm×250 mm。

1.3血清样品的采集与保存 所有受试者于自然月经周期或孕激素撤退出血的第3天上午采血，常温静置30 min，以3 000 r/min离心10 min后分离血清，收集上清液分装后，置于-80 ℃冰箱保存，待标本全部收集完一次性检测。

1.4iTRAQ标记及高效液相色谱法分级 将2组受试者血清等量混合，离心后取上清液，去除高丰度蛋白，使用BCA法对蛋白进行定量。从2组样品中各取30 μL蛋白质溶液电泳检测高丰度蛋白去除情况。Strata X C18(phenomenex)对酶解后的蛋白样品进行脱盐处理，根据iTRAQ试剂盒操作说明标记肽段(每5例混合为1个样品，每组3个样品，共计6个样品，分别进行肽段标记)，采用高pH反相液相色谱分离标记肽段，色谱柱为Acquity UPLC®BEH C18 1.7 μm, 2.1×50 mm。

1.5质谱分析 Q-ExativeHF质谱仪加热毛细管采用数据依赖模式自动在MS和MS/MS间切换采集。全扫描MS使用Orbitrap进行一级扫描，随后使用高能碰撞解离(Higher energy C-trap dissociation, HCD)对符合串级(MS/MS)碎裂条件的强度前10名母离子进行碎裂并用orbitrap进行扫描。将质谱数据输入到Proteome Discoverer(PD) 软件，对质谱谱图进行筛选。PD提取后的谱图用masco (version 2.3.2 , Matrix Science)t进行搜索，搜索结束后，PD软件根据mascot搜索结果和第一步筛选后的谱图进行定量分析。

1.6统计学方法 采用SPSS 19.0软件建立数据库，差异蛋白质点检测采用单因素方差分析，依据蛋白质丰度水平，差异蛋白筛选条件为匹配独有肽段个数≥1，差异倍数>1.2或<0.83，且P-value值<0.05。

2 结 果

2.1质谱鉴定结果 将2组样品间的蛋白质表达差异倍数>1.20 或<0.83且P-value<0.05作为差异表达蛋白的筛选标准，共筛选出87种差异表达蛋白，其中10种蛋白表达上调，77种蛋白表达下调，部分差异表达蛋白见表1。

表1 PCOS痰湿证患者与健康对照者血清中部分差异表达蛋白

2.2差异表达蛋白KEGG通路注释聚类分析 通过对差异表达蛋白显著富集的代谢通路进行分析，共涉及8条KEGG信号/代谢通路。其中补体与凝血级联反应富集到22个差异蛋白，金黄色葡萄球菌感染富集到7个差异蛋白，百日咳信号/代谢通路富集到6个差异蛋白，胆固醇代谢富集到5个差异蛋白，细胞外基质受体相互作用和系统性红斑狼疮分别富集到4个差异蛋白，维生素消化吸收和戊糖磷酸途径分别富集到2个差异蛋白，见表2。

表2 PCOS痰湿证患者与健康对照者差异表达蛋白参与的信号通路

2.3差异表达蛋白GO注释富集分析 GO功能注释与显著性富集分析结果显示，筛选出的差异蛋白参与的主要生物学过程包括蛋白质活化级联、急性炎症反应、蛋白的加工调控、体液免疫反应的调节等；参与的主要分子功能包括抑制活性、调节活性及结合相关；这些差异蛋白位置分布涉及细胞外区、囊泡、血液微粒、内质网内腔，且富集程度较高。见图1。

3 讨 论

PCOS中医病机以肾虚为本，痰瘀阻滞为标。痰湿既是人体脏腑功能失调产生的代谢产物，又能影响脏腑、经络、气血，成为导致疾病发生发展的致病因素。从微观分子层面利用蛋白质组学技术寻找发病相关的特异性蛋白质，可为PCOS中医辨证论治提供新的思路与方法。本研究利用iTRAQ技术联合LC-MS/MS，对PCOS痰湿证和健康对照者的血清蛋白进行分析，发现了87种差异表达蛋白，通过KEGG通路注释聚类分析提取到8条KEGG 信号/代谢通路，显著性差异蛋白主要集中在补体与凝血级联反应、金黄色葡萄球菌感染、百日咳、胆固醇代谢、细胞外基质受体相互作用、系统性红斑狼疮、维生素消化吸收和戊糖磷酸途径，提示PCOS痰湿证的病理机制可能通过上述信号通路发生作用。

作为炎性因子的补体C3是脂肪细胞产生和分泌补体途径中的关键因子，C3的裂解片段C3a对血清中的游离脂肪酸有清除作用，可调节血脂代谢平衡。脂肪组织越多分泌的补体C3越多[7]，脂代谢紊乱时，内源性C3水平升高可能与IR和肥胖有关[8]。补体 C3亦被认为是炎症反应、糖脂代谢的枢纽。有研究显示，与健康对照组比较，PCOS患者血清C3水平明显升高且腰围和三酰甘油(TG)与C3水平呈正相关[9]。本研究结果显示，PCOS患者补体C3表达量降低，并显著富集于补体和凝血级联反应、金黄色葡萄球菌感染、百日咳、系统性红斑狼疮4条信号通路上，说明补体C3通过炎症作用和免疫级联反应在PCOS痰湿证发病过程中发挥作用。

载脂蛋白B(apolipoprotein B，apoB)是一种多态性蛋白，由不同的氨基酸合成，分为apoB45和apoB100两大亚类，其中apoB45主要存在于乳糜微粒中，apoB100是低密度脂蛋白颗粒的主要载脂蛋白,也是低密度脂蛋白受体的配体，是胆固醇合成和脂类运载的主要物质，可反映脂质异常和致动脉粥样硬化脂蛋白的颗粒数[10]。国内一项研究表明，PCOS患者apoB/载脂蛋白A(apolipoprotein A，apoA)比值与IR的严重程度成正相关，随着apoB/apoA1比值的升高，机体发生IR的风险及严重程度逐渐增高[11]，表明apoB、apoB/apoA1可作为PCOS患者评估IR发生的程度和风险的可靠指标，可作为PCOS糖脂代谢异常的评价指标。本研究结果显示apoB表达量下调，并显著富集于胆固醇代谢、维生素消化吸收2条信号通路上，表明PCOS痰湿证患者在血脂代谢中可能发生紊乱或障碍。由此推测，apoB可能是PCOS痰湿证的特异性蛋白标志物，但其作用机制仍需进一步研究阐明。

维生素D结合蛋白是参与维生素D转运的主要蛋白，调节维生素D的代谢和分布，与游离维生素D的代谢产物25(OH)D呈负相关，与总25(OH)D呈正相关[12]。维生素D影响着女性生殖系统疾病，PCOS患者维生素D缺乏更为常见[13],国外研究表明，维生素D结合蛋白基因多态性与PCOS患者体内维生素D及睾酮水平相关并可用来作为预测PCOS合并IR的指标[14-15]，提示维生素D结合蛋白通过调节PCOS患者25(OH)D水平，对性腺功能起到调节作用。本研究中维生素D结合蛋白下调，提示维生素D结合蛋白在PCOS痰湿证的发病中可能发挥着维持维生素D转运功能的作用，其表达下调使得PCOS不断进展。同时研究表明维生素D结合蛋白除了在维生素D代谢中起关键作用，还参与机体免疫调节功能，提示维生素D结合蛋白在炎症调控方面发挥作用[16]。

综上所述，采用iTRA技术及 LC-MS/MS的蛋白质组学检测技术，寻找到补体C3、aopB、维生素D结合蛋白等12种与PCOS痰湿证相关的差异表达蛋白质，这些蛋白涉及PCOS痰湿证发病相关的补体系统、炎症作用、免疫级联反应、糖脂代谢等系统，可能是PCOS痰湿证特异性血清标志物。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。