高效除油微生物的筛选及除油效果试验研究

胡亚冬，雷明科，侯胜春，邓少雅，范德朋

（碧沃丰生物科技（广东）股份有限公司，广东 佛山 528200）

石油被称为工业的血液，主要成分是烷烃、环烷烃和芳香烃[1]。在勘探、开采、炼制、清罐和储运过程中，由于事故、跑冒滴漏、自然沉降等原因，大量石油与土壤或其他杂质形成混合物，这就是石油污泥，简称油泥[2]。油泥成分复杂，含有大量老化原油、沥青质、胶质、石蜡、悬浮固体以及各种酸性与腐烛性药剂，具有难降解、有毒、有害等特点，直接堆放在自然环境中，会造成土壤、植被和水体等生态系统的污染[3]。近年来，众多含油污泥处理方法在国内外普遍应用，物理法有填埋、分散施耕和调质离心分离等，化学法有焚烧、固化处理、氧化降解和热解等，它们本身存在不足，成本高，易造成二次污染。生物法特别是微生物修复技术，因其成本低，节能环保，降解彻底，目前被公认是最具潜力的石油污染治理方法。本研究从石油污泥中富集、筛选得到高效除油微生物，对其进行形态学观察和分子生物学鉴定，并初步研究了其对含油污泥的除油效果，为石油污染土壤的治理和修复提供更多微生物资源和试验数据。

1 试验过程

1.1 试验材料

石油污泥来自东营油田石油污染土壤，其石油类含量为3.52×104mg/kg，菌落数为1.20×107CFU/g。化学试剂采购自广州化学试剂厂，均为分析纯。生物学试剂采购自广东环凯微生物科技有限公司。润滑油为摩润克润滑油有限公司46 号润滑油，密度为0.8 g/mL。此外，试验材料还有五类。

1.1.1 微量元素溶液

乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）浓度为28 g/L，七水硫酸亚铁浓度为2 g/L，七水硫酸锌浓度为1.56 g/L，无水氯化钙浓度为2.2 g/L，七水硫酸镁浓度为4 g/L，一水硫酸锰浓度为1.76 g/L，四水合钼酸铵浓度为0.44 g/L，五水硫酸铜浓度为0.64 g/L，六水氯化钴浓度为0.64 g/L。

1.1.2 基础培养基

硫酸铵浓度为1 g/L，硝酸钾浓度为1.5 g/L，酵母浸粉浓度为1 g/L，七水硫酸镁浓度为0.4 g/L，1 mol/L 磷酸缓冲液添加量为10 mL/L，微量元素溶液添加量为5 mL/L，pH 保持在7.0～7.2。

1.1.3 测试培养基

润滑油浓度为8 g/L，硫酸铵浓度为0.4 g/L，硝酸钾浓度为0.6 g/L，酵母浸粉浓度为0.1 g/L，七水硫酸镁浓度为0.04 g/L，1 mol/L 磷酸缓冲液添加量为1.5 mL/L，微量元素溶液添加量为0.5 mL/L，pH 保持在7.0～7.2。

1.1.4 营养肉汤培养基

蛋白胨浓度为10 g/L，牛肉浸粉浓度为3 g/L，氯化钠浓度为5 g/L，pH 保持在7.0～7.2。营养肉汤固体培养基在此基础上加入2%的琼脂粉。

1.1.5 筛选平板

基础培养基中加入2 g/L 琼脂，倒好平板备用。另取5 mL 润滑油溶于45 mL 石油醚中，用0.22 μm滤膜过滤除菌。每个平板取1 mL 已过滤除菌的润滑油溶液涂布于凝固平板上，待石油醚挥发后即可使用。

1.2 仪器设备

主要仪器设备有DLHR-802 恒温振荡器、GI54DWS 立式压力蒸汽灭菌器、T6 新世纪紫外可见分光光度计和OIL 480 红外线测油仪。

1.3 试验方法

1.3.1 除油菌的富集与筛选

取石油污泥约10 g，将其加入到100 mL 基础培养基中，30 ℃温度下振荡培养2 周左右，获得富集培养液。富集培养液用生理盐水稀释到不同浓度并涂布于筛选平板，30 ℃温度下培养5～7 d。从筛选平板上挑取菌落191 个，接种于测试培养基中，温度30 ℃和转速150 r/min 条件下培养2 周。培养结束后，采用紫外分光光度法测定润滑油含量，并计算2 周内润滑油降解速率。

1.3.2 除油菌的分子生物学鉴定

挑选润滑油降解速率较高的两种菌落B016 和B069，进行形态学观察和分子生物学16SrDNA 序列鉴定，测序由广州艾基生物技术有限公司完成，序列通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）Blast 数据库进行比对，初步鉴定种属。

1.3.3 菌株对石油污泥除油效果的研究

将B016 和B069 分别接种至营养肉汤培养基中，温度30 ℃和转速150 r/min 条件下培养过夜；准备12个锥形瓶（容积500 mL），每瓶加入10 g 石油污泥，并补充100 mL 基础培养基，振荡混匀。分组时，石油污泥混合物中，B016 组加入B016 培养过夜的菌液1 mL，B069 组加入B069 培养过夜的菌液1 mL，（B016+B069）混合组加入B016、B069 培养过夜的菌液各0.5 mL。空白组不加入菌液作为对照。温度30 ℃和转速150 r/min 条件下振荡培养7 d。每组设置3 个平行。培养7 d 后，残留的石油类浓度依据《水质 石油类和动植物油类的测定 红外分光光度法》（HJ 637—2018）进行检测[4]。

1.4 分析方法

润滑油含量检测采用紫外分光光度法[5]，利用润滑油在波长260 nm 处有特征吸收峰的特点测定润滑油含量，计算润滑油降解速率，单位为mg/（L·d）。石油类含量检测采用红外分光光度法[4]。

2 结果与讨论

2.1 除油菌的筛选及形态观察

经初筛和复筛，获得2 株有较好除油性能的菌株B016 和B069。在润滑油底物浓度为8 g/L 的条件下，B016 和B069 的润滑油降解速率分别达到199.0 mg/（L·d）和109.5 mg/（L·d）。形态观察如图1、图2所示，B016 和B069 均为革兰氏阴性杆菌，但两者菌落特征不一致。B016 菌落表面粗糙不透明，呈黄色，边缘呈裂叶状，有环形褶起；B069 菌落表面光滑不透明，呈乳白色和凸圆状。

图1 B016 的革兰氏染色镜检图（放大1 000 倍）

图2 B069 的革兰氏染色镜检图（放大1 000 倍）

2.2 除油菌的分子生物学鉴定

B016 和B069 的纯种培养液经16srDNA 测序，序列经NCBI Blast 数据库比对，B016 与裂解亚氯酸假单胞菌（Pseudomonas chloritidismutan）的相似度最高，匹配度达99.93%；B069 与嗜根寡养单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）的相似度最高，匹配度达99.64%。根据比对结果，菌株B016 为假单胞菌属，菌株B069 为寡养单胞菌属。

2.3 菌株对石油污泥除油效果的研究

为考察B016 和B069 对石油污泥的实际除油效果，以1#石油污泥为底物（底物中石油类浓度3 520 mg/L），进行摇瓶试验。结果显示，在摇瓶培养条件下，空白组、B016 组、B069 组和混合组的石油类去除率分别为17%、86%、70%和92%，如图3所示。空白组因石油污泥中也含有原生土著菌，在该试验条件下，7 d 土著微生物除油率平均为17%，而加入除油微生物B016、B069 进行生物强化后，除油效果大大增加，特别是混合组除油率要大于单菌组，说明微生物除油可能存在一定的协同促进作用。而这种协同机制在复杂有机物（烃类、芳香族）的微生物降解中也是普遍存在的[6]。

图3 菌株实际除油效果

3 结论

本研究在石油污泥中筛选出两株较高除油效率的菌株，经16srDNA 分子生物学鉴定，菌株B016 为假单胞菌属，菌株B069 为寡养单胞菌属。润滑油底物浓度为8 g/L 时，测定除油菌对润滑油的降解速率，B016为199.0 mg/（L·d），B069 为109.5 mg/（L·d）。B016 和B069 以实际石油污泥为底物进行摇瓶试验，7 d内石油类去除率分别达到86%、70%。两者混合投加，具有一定的协同促进作用，去除率可达到92%。