Tspan8基因敲除联合安罗替尼对结肠癌SW480细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

谢转红，许云鹏，马珲敏，王祥

0 引言

结肠癌是结肠上皮来源的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处，2020年全球结肠癌发病率和死亡率分别位居全部肿瘤的第四位和第五位[1]。虽然其筛查和治疗手段迅速发展，但由于肿瘤转移和治疗耐药，使晚期复发性、转移性、难治性结肠癌患者的死亡率居高不下，5年生存率不超过17%[1]，因此，寻找更为有效的治疗方案成为研究热点。近年来，靶向药物治疗为结肠癌患者带来了新的希望，现已研制出数种针对血管内皮细胞生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）、血小板衍生生长因子受体（platelet derived growth factor receptor,PDGFR）、成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor,FGFR）及c-Kit等靶点的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKI）。安罗替尼（anlotinib）作为我国自主研发的小分子多靶点TKI，可抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞的生长及转移[2-3]，因具有可控的不良反应、较长的半衰期及广谱的抗肿瘤活性等特点[4]，现已被批准用于非小细胞肺癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤的三线治疗[5-8]。研究发现，安罗替尼在结肠癌治疗中同样安全有效[9-10]。与瑞戈非尼和呋喹替尼相比，安罗替尼不仅疗效相当，且不良反应更小[11]。表明安罗替尼有望成为结肠癌患者的新选择。

Tspan8是四跨膜蛋白超家族（transmembrane 4 super family,TM4SF）中的一员，对肿瘤细胞的恶性生物学行为具有极其重要的影响。研究发现Tspan8主要高表达于消化系统恶性肿瘤，如结直肠癌中，其表达水平与肿瘤的转移潜能呈正相关，而与患者的生存预后呈负相关[12-16]。提示Tspan8很有可能成为结肠癌治疗的潜在靶点。

本实验以结肠癌SW480细胞为研究对象，探讨安罗替尼联合Tspan8敲除对SW480细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人结肠癌SW480细胞、HEK293T细胞购自ATCC公司。安罗替尼（10 mg）购自江苏正大天晴公司；高糖DMEM培养基购自上海源培公司；胰蛋白酶、青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液、结晶紫和MTT检测试剂盒购自北京Solarbio公司；FΒS购自美国AΒW公司；DMSO购自德国ΒioFroxx公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶和FITC偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒购自美国ΒD公司；RIPA裂解液购自上海雅酶公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购自上海Βeyotime公司；多聚甲醛固定液和ΒCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海Βiosharp公司；Anti-Tspan-8抗体购自美国Abcam公司；β-TubulinMouse mAb购自上海Abmart公司；Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）购自美国Proteintech公司；去内毒素质粒快速小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、Gibson无缝连接试剂盒均购自兰州华帜天成公司；限制性内切酶ΒsmΒI购自北京NEΒ有限公司；嘌呤霉素购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；聚凝胺购自上海经科公司。

CO2恒温培养箱、多功能连续光谱（Thermo Fisher）为美国Thermo Scientific Forma公司产品；倒置相差显微镜AE2000为厦门Motic公司产品；倒置荧光显微镜MF52为广州明美光电公司产品；正置荧光显微镜ΒX53+DP74为日本奥林巴斯公司产品；医用离心机80-2为苏州新康医疗器械公司产品；高速冷冻型微量离心机D3024R为美国Scilogex公司产品；多功能酶标仪SpectraMAX M2为上海Molecular Devices公司产品；流式细胞分析仪CytoFLEX为美国Βeckman公司产品；化学发光成像系统JS-M6P为上海培清公司产品。全自动凝胶成像分析系统ChampGel6000、迷你型化学发光荧光成像分析系统MiniChemi 610 plus为北京赛智公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

所有细胞均培养于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中。高糖DMEM培养基中添加10%FΒS和1%三抗配制成完全培养基。0.5%胰蛋白酶消化传代。所有实验均采用对数生长期细胞。

1.2.2 Tspan8基因敲除

1.2.2.1 Tspan8敲除质粒的构建 在NCΒI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查询并拷贝Tspan8的基因序列（Gene ID: 7103），使用规律呈簇的间隔短回文重复/CRISPR相关核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9,CRISPR/Cas9）在线设计工具网站（http://crispr.mit.edu），设计针对Tspan8的3个单向导RNA（single guide RNA,sgRNA）序列，见表1。根据sgRNA序列，得到三对单链sgRNA引物，见表2。将其退火形成二聚体，通过Gibson无缝连接试剂盒与经限制性内切酶ΒsmΒⅠ酶切的lenti-CRISPR v2载体连接。将连接产物转化到stbl3感受态细胞中，经氨苄青霉素抗性平板筛选，提取质粒后进行单克隆测序。

表1 针对Tspan8的三条sgRNA序列Table 1 Three sgRNA sequences targeting Tspan8

1.2.2.2 Tspan8慢病毒的制备 取HEK293T细胞接种于培养皿，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染，36 h后离心取上清液备用。

1.2.2.3 Tspan8基因敲除细胞株的构建 取SW480细胞接种于6孔板，加入1 ml的慢病毒毒液和2 μl的聚凝胺（8 mg/ml），48 h后用嘌呤霉素（2 μg/ml）筛选，7 d后收集细胞，提取蛋白进行敲除效果验证。

1.2.2.4 Western blot法检测Tspan8基因敲除效果 收集待测细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解，12000 r/min，4℃离心15 min，取少量上清液，按照说明书进行各组蛋白浓度测定。配置10%SDSPAGE电泳，PVDF膜进行转膜，5%脱脂牛奶封闭，TΒST洗膜，一抗（Anti-Tspan-8抗体、β-TubulinMouse mAb）4℃孵育过夜，次日加入二抗（Goat Anti-Rabbit IgG（H+L））室温孵育1 h，TΒST洗膜，涂匀ECL发光液，并用JS-M6P化学发光成像系统进行显影。Image J软件分析各蛋白条带的灰度值，Tspan8表达水平=Tspan8条带灰度值/内参条带灰度值。

1.2.3IC50的测定

取SW480细胞，以5×104个/孔接种于96孔板，贴壁后用安罗替尼（0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128 μmol/L）处理（24、48和72 h），每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml）孵育4 h，150 μl DMSO震荡15 min，在570 nm波长的多功能酶标仪中测量各孔的光密度（optical density,OD）值，并计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）。细胞增殖抑制率（%）=[（1-OD值实验组）/OD值对照组]×100%，每组设置5个复孔。

1.2.4 实验分组

对照组（SW480细胞用完全培养基培养）、安罗替尼组（SW480细胞用14 μmol/L安罗替尼处理）、Tspan8敲除组（SW480-KO-Ⅲ细胞用完全培养基培养）和联合组（SW480-KO-Ⅲ细胞用14 μmol/L安罗替尼处理）。

1.2.5 细胞增殖实验检测细胞增殖能力

细胞以5×104个/孔接种于96孔板，贴壁后根据实验分组进行处理，采用MTT法测定0、1、2、3和4 d各组OD值，并绘制生长曲线，每组设置5个复孔。

1.2.6 克隆形成实验检测细胞成活能力

细胞以2.5×106个/孔接种于6孔板，贴壁后根据实验分组处理24 h，后消化重悬细胞并以1×103个/孔接种于新的6孔板孵育，直至出现肉眼可见的细胞集落时终止培养，每孔加入4%多聚甲醛固定液1.5 ml固定30 min，0.1%结晶紫1.5 ml染色30 min后洗涤、风干、拍照，并对50个细胞以上的细胞集落进行计数，每组设置3个复孔。

1.2.7 划痕实验检测细胞迁移能力

细胞以1×106个/孔接种于6孔板，贴壁后用200 μl枪头进行划痕，根据实验分组处理细胞0、24和48 h，并用倒置荧光显微镜（×100倍镜）观察和拍摄，Image J软件测定划痕宽度，并计算细胞划痕迁移率。细胞划痕迁移率=[（0 h的划痕宽度-24或48 h的划痕宽度）/0 h的划痕宽度]×100%。各组设置3个复孔。

1.2.8 Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力

根据实验分组制备单细胞悬液（均不含FΒS），以8×105个/孔接种到上室，下室加入600 μl含15%FΒS的完全培养基，48 h后用棉签擦去上室残留细胞，4%多聚甲醛固定液600 μl固定30 min，0.1%结晶紫600 μl染色30 min后洗涤、风干，在正置荧光显微镜（×100倍镜）随机选取5个视野观察细胞形态并计数。

Transwell侵袭实验：提前将Matrigel基质胶从-20℃冰箱取至4℃冰箱备用，于冰上用高糖DMEM培养基以1:50比例配制成稀释液，取100 μl稀释液包被到上室底面，待基质胶凝固后，制备单细胞悬液并以1.6×106个/孔接种于上室，后续操作同上述Transwell迁移实验。

1.2.9 流式细胞术检测细胞凋亡水平

细胞以2.5×106个/孔接种于6孔板，贴壁后根据实验分组处理48 h，按照FITC偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒说明书进行操作，并于1 h内上机检测。

1.2.10 Western blot法检测安罗替尼对SW480细胞Tspan8表达水平的影响

取SW480细胞，以2.5×106个/孔接种到6孔板中，贴壁后分别加入安罗替尼（14 μmol/L）和完全培养基，48 h后检测Tspan8的表达水平，方法同1.2.2.4。

1.3 统计学方法

应用Image J软件进行图像分析，实验数据以均数±标准差表示；采用SPSS25.0和GraphPad Prism 8软件进行统计学分析；多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tspan8敲除质粒的构建

挑选转染成功的耐药阳性克隆菌株，菌液PCR鉴定后扩大培养，提取阳性单克隆质粒lentil CRISPR-sgTspan8-Ⅰ、lentil CRISPR-sgTspan8-Ⅱ和lentil CRISPR-sgTspan8-Ⅲ进行测序，结果见图1。说明3条目的Tspan8 sgRNA序列分别已经正确插入载体，证明用于Tspan8基因敲除的3个重组质粒构建成功。

图1 三种Tspan8敲除质粒的序列比对图及测序峰图Figure 1 Sequence alignment and sequencing peaks of three Tspan8 knockout plasmids

2.2 Tspan8稳定敲除结肠癌SW480细胞珠的筛选

Western blot结果显示，结肠癌SW480-WT、SW480-KO-Ⅰ、SW480-KO-Ⅱ和SW480-KO-Ⅲ细胞中Tspan8的表达水平分别为0.89±0.06、0.78±0.02、0.42±0.04和0.17±0.03。与SW480-WT、SW480-KO-Ⅰ、SW480-KO-Ⅱ细胞相比，SW480-KO-Ⅲ细胞中Tspan8的表达量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。因此选择敲除效率最高的结肠癌SW480-KO-Ⅲ细胞进行后续实验。

图2 Western blot法检测慢病毒感染结肠癌SW480细胞后Tspan8的表达Figure 2 Western blot was used to detect Tspan8 expression in colon cancer SW480 cells infected with lentivirus

2.3 MTT法检测各组细胞的增殖能力

MTT法结果显示，与0 μmol/L组比较，不同浓度的安罗替尼均能抑制结肠癌SW480细胞的增殖（均P＜0.01），细胞增殖抑制率呈浓度-时间依赖性，见图3。安罗替尼对结肠癌SW480细胞24、48和72 h的IC50值分别为25.24±6.16、14.41±3.58和8.41±1.97 μmol/L。因后续实验时间需要观察48 h，故而选择14 μmol/L为实验浓度。

图3 不同浓度和不同时间安罗替尼作用后对结肠癌SW480细胞抑制率Figure 3 Inhibitory rate of colon cancer SW480 cells treated with different anlotinib concentrations at different times

进一步检测各组结肠癌细胞在不同时间（0、1、2、3和4 d）的增殖能力发现，与对照组相比，安罗替尼组、Tspan8敲除组和联合组在1、2、3和4 d的细胞增殖速度明显下降（P＜0.01）；且联合组细胞在2、3和4 d的增殖速度明显低于安罗替尼组（P＜0.01），但在1 d时两组差异无统计学意义（P＞0.05），而联合组细胞的增殖速度整体低于Tspan8敲除组，但除了在1 d和2 d时差异有统计学意义以外（P＜0.01），3 d和4 d两组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

图4 各组结肠癌SW480细胞的生长曲线Figure 4 Growth curves of colon cancer SW480 cells in each group

2.4 克隆形成实验检测各组细胞贴壁后的成活能力

克隆形成实验结果显示，对照组、安罗替尼组、Tspan8敲除组和联合组的克隆形成数分别为84.33±7.23、47.33±15.04、10.00±6.08和1.33±0.58。与对照组相比，安罗替尼组、Tspan8敲除组和联合组的克隆形成数目明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01），且联合组的克隆形成数目整体少于安罗替尼组（P＜0.01）和Tspan8敲除组（P＞0.05），见图5。结果表明安罗替尼联合Tspan8敲除对结肠癌SW480细胞的克隆形成能力具有明显抑制作用。

图5 各组克隆形成实验结果Figure 5 Results of clonal formation experiment in each group

2.5 划痕实验和Transwell小室迁移法检测各组细胞的迁移能力

对照组、安罗替尼组、Tspan8敲除组和联合组的24 h细胞划痕迁移率分别为（20.92±8.30）%、（13.76±5.77）%、（8.62±1.97）%和（7.47±3.82）%；48 h细胞划痕迁移率分别为（48.40±11.98）%、（20.39±5.17）%、（15.94±3.27）%和（13.01±4.85）%。与对照组相比，安罗替尼组、Tspan8敲除组和联合组24 h和48 h的细胞划痕迁移率均明显减小，差异有统计学意义（P＜0.01）。且联合组24 h和48 h的细胞划痕迁移率明显低于安罗替尼组（P＜0.01）和Tspan8敲除组（P＜0.01），见图6。结果表明安罗替尼联合Tspan8敲除对结肠癌SW480细胞的迁移能力具有明显抑制作用。

图6 各组划痕修复实验结果Figure 6 Results of scratch repair experiment in each group

对照组、安罗替尼组、Tspan8敲除组和联合组的迁移细胞数分别为72.00±13.07、60.04±15.27、45.33±8.47和21.09±7.25个。与对照组相比，安罗替尼组、Tspan8敲除组和联合组的迁移细胞数明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01），且联合组的迁移细胞数明显少于安罗替尼组（P＜0.01）和Tspan8敲除组（P＜0.01），见图7。结果表明安罗替尼联合Tspan8敲除对结肠癌SW480细胞的迁移能力具有明显抑制作用。

图7 各组Transwell小室迁移结果Figure 7 Results of Transwell compartment migration in each group

2.6 Transwell小室侵袭法检测各组细胞的侵袭能力

对照组、安罗替尼组、Tspan8敲除组和联合组的侵袭细胞数分别为52.14±8.35、24.07±4.36、21.26±6.43和14.31±4.33个。与对照组相比，安罗替尼组、Tspan8敲除组和联合组的侵袭细胞数明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01），且联合组的侵袭细胞数明显少于安罗替尼组（P＜0.01）和Tspan8敲除组（P＜0.01），见图8。结果表明安罗替尼联合Tspan8敲除对结肠癌SW480细胞的侵袭能力具有明显抑制作用。

图8 各组Transwell小室侵袭结果Figure 8 Results of Transwell compartment invasion in each group

2.7 流式细胞术检测各组细胞的凋亡水平

对照组、安罗替尼组、Tspan8敲除组和联合组细胞的早期凋亡率分别为（2.42±0.96）%、（6.48±1.51）%、（7.48±0.35）%和（17.78±3.00）%。与对照组相比，安罗替尼组、Tspan8敲除组和联合组细胞的早期凋亡率明显提高，差异有统计学意义（P＜0.01），且联合组的早期凋亡率明显高于安罗替尼组（P＜0.01）和Tspan8敲除组（P＜0.01），见图9。结果表明安罗替尼联合Tspan8敲除能够明显促进结肠癌SW480细胞发生凋亡。

图9 各组流式细胞术结果Figure 9 Results of flow cytometry in each group

2.8 安罗替尼对SW480细胞Tspan8表达水平的影响

对照组和安罗替尼组结肠癌SW480细胞中Tspan8蛋白的表达水平分别为0.92±0.01和0.49±0.15。与对照组相比，安罗替尼组Tspan8蛋白的表达量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图10。结果表明安罗替尼作用后可明显抑制结肠癌SW480细胞中Tspan8的表达。

图10 Western blot法检测对照组和安罗替尼组SW480细胞中Tspan8的表达水平Figure 10 Western blot was used to detect the expression of Tspan8 in SW480 cells of control group and anlotinib group

3 讨论

结肠癌的临床表现不典型，大多数病例被发现时已处于中晚期。目前结肠癌临床治疗采取多学科综合治疗模式，强调个体化原则，中晚期以手术为主，辅以放化疗、靶向治疗等[17-18]。然而由于手术效果不满意、放化疗敏感度差等因素，导致结肠癌患者的预后较差，严重危害着人类健康。因此，寻找更为有效的治疗方案迫在眉睫。

研究发现，安罗替尼可通过作用于VEGFR、PDGFR、FGFR、c-Kit等靶点，阻断PI3K/AKT、AKT/ERK、EGFR/MET/AΒCΒ1以及VEGFR/JAK2/STAT3等信号通路，抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成，并诱导结肠癌细胞凋亡，从而发挥抗增殖、抗转移、抗血管生成以及抗多重耐药等作用[19-22]。Tspan8作为肿瘤相关抗原，在肿瘤组织和肿瘤细胞中的表达水平明显高于正常组织和正常细胞，上调Tspan8的表达可明显增强肿瘤细胞的生长、转移、放化疗抵抗，而外源性沉默Tspan8的表达，可显著抑制肿瘤细胞的增殖生长、迁移侵袭，并增加肿瘤细胞对放化疗的敏感度。以上作用主要与MAPK/ERK/MEK、AKT/ERK、PI3K/AKT以及MAPK/AKT等信号通路相关[23-27]。根据上述研究结果，安罗替尼和Tspan8敲除均具有显著的抗肿瘤作用，且通过相似信号通路产生影响。所以我们猜想，安罗替尼与Tspan8敲除两者联合可能具有协同抑制肿瘤细胞活性的能力，但目前尚无相关研究数据支持。因而，本实验探究了安罗替尼与Tspan8敲除联合作用对结肠癌SW480细胞恶性生物学行为的影响，结果显示，与对照组比，安罗替尼或Tspan8敲除均能够明显抑制结肠癌SW480细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力，诱导结肠癌SW480细胞发生凋亡，且两者联合时上述作用更强。此外，与安罗替尼单独作用相比，联合组细胞的早期凋亡率明显提高，细胞增殖速度、克隆形成数目、划痕愈合率和Transwell迁移及侵袭数目显著减小。而与Tspan8敲除单独作用相比，联合组细胞仅在早期凋亡、划痕愈合、Transwell迁移和侵袭方面的差异明显，而在细胞增殖方面，如生长曲线和克隆形成，虽然联合组的总体水平低下，但两者差异无统计学意义。这可能与Tspan8敲除明显抑制结肠癌细胞的增殖有关。

本研究还发现，与安罗替尼单独作用相比，Tspan8敲除组的结肠癌SW480细胞在增殖、克隆形成、迁移侵袭方面的整体水平较低，而凋亡水平略高。结合安罗替尼作用后，能够明显降低结肠癌SW480细胞中Tspan8的表达水平。故推测Tspan8的表达可能受到安罗替尼的影响。根据现有研究证据，Tspan8的转录与ERK/MEK信号通路的激活有关[28]，而安罗替尼可通过抑制ERK/MEK信号通路发挥抑癌作用。所以此表型很有可能与ERK/MEK信号通路相关。

结合上述结果，我们推测安罗替尼联合Tspan8敲除主要通过抑制ERK/MEK信号通路发挥协同抗结肠癌作用，且安罗替尼也可通过抑制ERK/MEK通路影响Tspan8的表达，具体机制尚待进一步研究证实。

综上所述，本实验不仅首次证明了安罗替尼联合Tspan8敲除具有协同抑制结肠癌SW480增殖转移的作用，而且还首次发现了安罗替尼可明显降低结肠癌SW480细胞中Tspan8的表达水平，同时探讨了其可能相关的机制。后续本课题组将进行安罗替尼联合Tspan8敲除在结肠癌SW480细胞中具体机制、信号通路及动物实验方面的研究，以期为结肠癌临床治疗提供一个新的思路。