烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）的耐热性研究

何鹏搏，李咏梅*，朱自萍，何鹏飞，何月秋，吴毅歆，蔡永占，符宗伟，Munir Shahzad，王军伟，田阳阳，王云月**

（1.云南农业大学，云南 昆明 650201；2.云南省烟草公司 曲靖市公司，云南 曲靖 655000；3.红塔烟草（集团）有限责任公司，云南 玉溪 653100）

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）在自然界普遍分布，广泛存在于海洋［1］和土壤，营腐生生活［2］，是土壤中优势真菌之一［3］，其还可以在植物中内生［4］，如在白三叶草［5］、蒜头果［6］、红茄莓［7］和霸王鞭［8］中内生。它对农药残留、废弃农用薄膜、蒽污染和农作物秸秆都有很好的降解作用［9］。然而，烟曲霉又是一种机会致病菌，它在人畜身体较弱时，也会引起疾病［10］，如它会引起肺曲霉菌病［11］，导致患者死亡［12-13］，引起角膜炎［14］等。该菌耐高温，能在55 ℃下生长［15］，在仓贮中易引起烟草霉变［16］，造成重大损失。为了给烟草霉烂病防控、人畜疾病控制及为有机肥发酵提供科学依据，本文开展了烟曲霉菌耐高温能力和引起霉烂病温度研究。

1 材料与方法

1.1 烟草品种和烟曲霉

烟草品种为云烟 105，取其中下部叶柄供接种试验。烟曲霉菌Q-1 （Aspergillus fumigatusQ-1，下称Q-1）为本实验室于2018年8月分离自云南省宣威市格宜镇宜兴烤烟合作社烤房烟草霉烂病样本，且已被证明它是烘烤期烟叶霉烂病菌之一。

1.2 烟曲霉Q-1的耐热性试验

1.2.1 常压下耐热性试验

1.2.1.1 菌丝体耐热性 将在PDA上培养好的Q-1，用0.3 cm打孔器打成菌饼，分别置于装有100 μL的灭菌水和空的PCR管内，将PCR管放入PCR仪（型号L96+，杭州朗基科学仪器有限公司）中检测菌体的耐热性。温度设置为40～95 ℃，以5 ℃为1节点，共12个温度节点，加热5 min和10 min，每个节点6次重复。处理过的菌饼加入适量的灭菌水，混匀后，涂布于PDA板上，于37 ℃下黑暗培养48 h后统计菌落数，统计存活率。

1.2.1.2 孢子耐热性 分生孢子耐热性分：（1）在空气中耐热性：取Q-1的分生孢子1 mg，加入PCR管中，于PCR仪中60～90 ℃处理10 min。（2）在水相中耐热性：将100 μL的1.5×106CFU/mL孢子液装入PCR管内，于PCR仪中50～95 ℃处理5 min和10 min。2种试验后，PCR管中均加灭菌水稀释，再涂于PDA板上，于37 ℃下黑暗培养48 h后统计菌落数，统计存活率。以上各处理均重复6次。

1.2.2 在加压下的耐热性试验 将在PDA上培养好的Q-1孢子用灭菌水洗下，混入121 ℃下间歇灭菌40 min和未灭过菌的2种烟草地土壤中，分成1 g装入试管，置于灭菌锅（型号LDZX-75KBX，上海申安医疗器械厂）中，121 ℃、0.105 MPa下灭菌20、30、35、40、45和50 min，10倍稀释后涂板于加有10 μg/mL的氯霉素（排除细菌的干扰）PSA平板上，置于37 ℃温箱中培养48 h，计数烟曲霉菌落数。以常温不灭菌处理为对照。各处理重复3次，每重复包括4个培养皿的平均菌落数，计算存活率。

1.3 高温处理烟曲霉Q-1的致病性试验

取新鲜的烟草叶柄，各切成长约1 cm的组织块，置于直径6 cm的培养皿中，每皿3段。培养皿垫有吸水纸，每皿加7 mL灭菌水保湿。接种Q-1的1.5×107CFU/mL孢子悬浮液100 μL于两端切口处，再分别置于50、60、65、70、80、90和95 ℃的培养箱中处理10 min后，取出后置于37 ℃保湿4 d，取出观察发病情况。各处理均重复3次。

2 实验结果

2.1 菌体的耐热性

2.1.1 在培养基上的耐热性 将Q-1菌饼分别放入有灭菌水和无灭菌水的PCR管中，于PCR仪上40～95 ℃温度下加热5 min和10 min，再放入PDA平板上培养，结果见表1。Q-1在40～95 ℃温度范围内，2种时间段分别处理后，再转入37 ℃下培养，所有处理和重复的菌饼均长出菌丝和分生孢子，即在95 ℃时，菌饼上的Q-1仍保存着生命力。

表1 烟曲霉Q-1菌丝体在有水和无水PCR管中的耐热性

2.2 分生孢子的耐热性

2.2.1 分生孢子在空气中的耐热性 将烟曲霉Q-1分生孢子直接放入离心管中，置于PCR仪中60～90 ℃加热处理10 min后，涂布于平板培养，发现其仍能长出菌落，表明烟曲霉Q-1分生孢子在60～90 ℃下10 min仍能存活，但存活率随着温度升高而下降，至80 ℃和90 ℃时，存活率仅分别0.14%和0.04%（表2）。

表2 烟曲霉Q-1孢子在不同温度下处理10 min的 存活情况

2.2.2 分生孢子在水相中的耐热性 将烟曲霉Q-1分生孢子制作成悬浮液，置于50～95 ℃分别处理5、10 min，培养48 h后，结果见表3。Q-1在70 ℃及以上温度处理时，均未长出菌落；处理5 min时，在68 ℃处理温度中，孢子存活率仅为6.25×10-6%；在65 ℃处理温度中，孢子存活率为 8.75×10-4%；在60 ℃处理温度中，仍有2.69%孢子存活。处理10 min时，在68 ℃处理温度中，无孢子存活；在65℃处理温度中，孢子存活率为1.25×10-4%；在60 ℃处理温度中，有0.29%孢子存活；在50 ℃处理温度中，有63.67%孢子存活。即随着温度升高和处理时间的延长，Q-1分生孢子在水相中存活力下降，其最高耐热率的培养温度和时间分别为68 ℃、5 min。

表3 烟曲霉Q-1孢子液在不同温度下的存活情况

2.3 烟曲霉在加压下对温度的耐受性

在121 ℃温度和0.105 MPa大气压下，灭菌与未灭菌土壤加入烟曲霉孢子液经几种灭菌时间处理后，烟曲霉的分生孢子死亡率都达100%。即烟曲霉虽然能耐高温，但是在121 ℃高温和0.105 MPa大气压下灭菌20 min及以上都不能存活。

2.4 不同温度处理的烟曲霉Q-1孢子引起烟草叶柄发病能力

将Q-1分生孢子悬浮液接种到烟草叶柄切口处，分别置于50～95 ℃的培养箱中处理10 min，培养4 d后叶柄处产生霉烂病症状结果见表4。接种烟草叶柄在涂布经80、90、95 ℃处理10 min的孢子悬浮液后未发病，而涂布经50、60、70 ℃处理的孢子悬浮液后均发生典型霉烂病，表明烟曲霉在50～70 ℃的烟草叶柄上仍能存活，孢子具有萌发和侵染能力。

表4 烟曲霉Q-1孢子液在烟草叶柄上于不同温度处理10 min的发病情况

3 讨论与结论

烟草霉烂病多发于烘烤过程中的高温高湿期，即变黄期和定色期，且在通风条件不好、密闭的烤房霉烂病愈发严重。有研究表明烟曲霉亦是烘烤期烟叶霉烂病病原之一。本研究结果表明烟曲霉在较高温度下仍能较好地存活，即使达95 ℃时，菌丝体和孢子仍能存活。总体来说，分生孢子耐受高温的能力弱于菌丝体，如以菌丝块置于气相和水相中，即使95 ℃处理10 min，在37 ℃下培养还能长出菌落，但将纯孢子置于水相中68 ℃以上，处理10 min后孢子就不能萌发。在空气中，分生孢子即使在80 ℃和90 ℃时，处理10 min后孢子存活率分别达0.14%和0.04%。然而，即使在80 ℃以上孢子存活率较低，但其对于产孢子量大的烟曲霉来说，其侵染潜力仍不可小觑。当把孢子液接种到烟叶柄切口处，放置于50～70 ℃温度下处理10 min，再转到37 ℃下，烟叶柄仍能出现典型的烟曲霉霉烂病。

张晋卿等［18］采用酵母浸膏培养基研究证明烟曲霉最适宜生长温度为37 ℃，最高生长温度为52 ℃；65 ℃处理180 min或70 ℃处理120 min均能使烟曲霉完全失活。但本研究采用水相下处理，在68 ℃下处理10 min后，孢子全部死亡；在空气中于60 ℃和90 ℃下处理10 min，孢子存活率仍达86.20%和0.04%，而菌丝体在95 ℃下处理10 min仍能存活。上述结果表明烟曲霉的耐热性很强，但笔者与张晋卿等的结论差异可能来自不同菌株及试验方法的不同所致。

由于烟曲霉是实验室操作中会经常引起污染，本研究证明它不能耐受在121 ℃和0.105 MPa下的灭菌处理，从而证明实验室出现烟曲霉污染是来自不严格的无菌操作所致，而不是其耐高温的缘故。

农作物附产品是农田有机质重要来源，为了加速该类有机质原料的腐熟，添加腐熟菌种是最常见的方法。然而，大多数有机肥发酵的温度都不会超过72 ℃，温度过高引起发酵菌功能下降，会延长发酵周期。本研究证明烟曲霉菌丝在气相下于70 ℃中仍能存活，在70 ℃下处理10 min，分生孢子仍然不失侵染烟草叶柄引起霉烂病的能力，展现了其用于发酵农业有机废弃物的潜力。