生物炭和碳酸钙粉对高、低镉积累型水稻镉积累及根际微生物群落的影响

唐仲，周明，张隽，赵方杰

（南京农业大学资源与环境科学学院，南京 210095）

农作物是土壤重金属镉（Cd）进入人体的重要载体，与其他粮食作物相比，水稻对土壤中重金属Cd的富集能力更强[1]，因此，农田土壤Cd污染和水稻安全利用问题亟待解决。在所有土壤理化性质当中，土壤pH值是对Cd的生物有效性影响最大的因素之一，这主要是由于pH通过影响Cd的吸附-解吸来影响Cd在土壤固液相的分配[2]。研究表明，Cd在酸性土壤环境中的溶解度会变大，其生物有效性也随之升高，更易被水稻等农作物吸收。陈宏坪等[3]通过采集Cd含量不同的8个水稻产区的水稻土进行盆栽试验发现，水稻籽粒中Cd含量与土壤pH值呈现明显的负相关，pH值越高水稻籽粒中Cd含量越低。有机质含量对土壤中Cd有效性的影响主要体现在部分固相大分子对Cd的吸附作用。土壤中大分子的固相腐殖质和胡敏酸能够与Cd产生吸附、螯合作用从而使土壤中Cd的生物有效性降低[4]。生物炭一般是以玉米秸秆、稻壳等富含有机质的农业废弃物为原料，在高温缺氧的条件下制成的稳定且碳含量较高的产物[5]。向土壤中添加生物炭能够增加土壤中有机质含量，此外，生物炭多为碱性材料，其结构疏松，比表面积大且碳表面官能团丰富，能够降低土壤容重，增加吸附能力，这些特性决定了生物炭能够在一定程度上降低土壤中Cd的生物有效性[5]。

水稻是一种较易富集Cd的农作物，不同水稻品种对Cd的吸收积累能力存在显著差异。有研究表明，籼稻吸收积累Cd的能力一般高于粳稻，而杂交稻与常规稻之间并无显著差异[6]。DUAN等[7]通过在华南三个中度污染地区种植471个适应当地环境的高产水稻品种试验发现，糙米中的Cd含量在不同种植条件下变化范围在10～32倍之间。曾翔等[8]通过选取46个水稻品种进行Cd胁迫试验发现，这些品种糙米中Cd含量差值最大达到6倍。由此可见，不同的水稻品种对其吸收积累Cd也有着非常重要的影响。

施用土壤钝化剂作为农作物降Cd的重要措施，对Cd的生物有效性存在显著影响。目前应用土壤钝化剂进行Cd污染农田的修复已被广泛报道[9-10]，但土壤钝化剂对于不同镉积累特性水稻的镉积累阻控效果存在差异。李翔等[11]在田间条件下研究了5种钝化剂对土壤pH、Cd有效态含量以及对4个粳稻品种Cd积累的影响，发现降低土壤有效态Cd效果最优的钝化剂对4个水稻品种籽粒Cd含量降低率差异最大能达到25%左右。刘艳等[12]在盆栽条件下比较了一种主要成分为CaO、MgO和SiO2的自研钝化剂对3个籼稻品种Cd富集系数的影响，发现钝化剂对不同水稻品种的糙米Cd富集系数存在不同影响，且不同土壤条件下的影响不同。虽然以上报道发现钝化剂对不同水稻品种糙米Cd含量降低效果存在差异，但并未对其差异原因深入探讨。本研究通过开展盆栽试验，比较生物炭和碳酸钙粉分别应用于高、低镉积累型水稻对Cd积累的阻控效果以及对高、低镉积累水稻根际细菌群落结构的影响，以期为Cd污染农田不同镉积累特性水稻安全生产过程中钝化剂的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

盆栽试验所用土壤采自广东省韶关市樟市镇北约村农田表层土壤（0～20 cm），将土壤风干过筛后备用。供试土壤pH为5.33，有机质含量为21.73 g·kg-1，土壤Cd含量为0.59 mg·kg-1，超过了《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618—2018）。盆栽试验所种植的水稻品种为低镉积累品种深优957（SY957）和高镉积累品种甬优538（YY538）[7]。本试验所用生物炭主要成分为稻壳、玉米秸秆等，购自南京勤丰众成生物质材料有限公司，该生物炭pH值为10.4，含碳量为576 g·kg-1，含氮量为4.66 g·kg-1，含磷量为5.33 g·kg-1，含钾量为26.61 g·kg-1，含镉量为0.13 mg·kg-1，灰分含量37.4%。所用碳酸钙（CaCO3，纯度为92.5%，100目，pH值为9.8，镉含量为0.11 mg·kg-1）购自粤江新材料有限公司。

1.2 试验设计

盆栽试验共分3种处理：对照处理（CK）、生物炭处理（BC，10 g·kg-1）以及碳酸钙处理（CaCO3，3 g·kg-1），每种处理设置4盆重复，总计12盆。每盆用土5 kg，分别将每个处理所需的生物炭或碳酸钙与土壤充分混匀后一分为二加入同一个塑料桶中（高30 cm，直径32 cm），中间用300目尼龙网隔开，并使之保持淹水状态，稳定2周后备用。两种水稻种子在南京农业大学牌楼科研基地育秧池中进行育苗工作，待水稻幼苗长到三叶一心时，选择长势一致的两种水稻秧苗各一株移植于同一盆土壤中300目尼龙网两边。所有处理在水稻扬花期前始终保持盆栽土壤处于淹水状态，表层水深约2 cm，水稻扬花以后不再淹水，仅保证土壤湿润直至水稻成熟。

1.3 样品采集与测定

水稻收获时采集水稻根际1～2 mm范围内的根际土，具体操作参照刘波等[13]的方法，先将植株从土壤中挖出，抖掉与根系松散结合的土体，然后将附着在根系表面1～2 mm范围的土壤用刷子刷下来作为根际土壤。取约0.5 g鲜土用于根际土壤微生物分析，其余土壤样品自然风干，研磨后过100目筛；土壤pH用蒸馏水按2.5∶1（V/m）的水土比浸提，振荡10 min，静置30 min，采用台式pH计（Mettler-Toledo）测定；土壤有效态Cd以0.01 mol·L-1CaCl2浸提；土壤样品、CaCO3和生物炭均采用HNO3-HCl法（1∶4，V/V）、石墨消解炉（ED54，Lab Tech）消解。

采集每株水稻的根系和秸秆样品，用自来水冲洗干净后于60℃烘干至质量恒定，粉碎后用HNO3-HClO4法（87∶13，V/V），石墨消解炉（ED54，Lab Tech）消解；采集每株水稻的稻穗样品于60℃烘干至质量恒定，测定每个处理下水稻的单株产量、结实率以及千粒质量等农艺性状，籽粒脱壳粉碎后用HNO3法，微波消解仪消解；土壤和水稻样品Cd含量采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，NexION，Perkin Elmer）检测，选择GSS-14和GBW10015（国家标准物质网）分别作为供试土壤、水稻样品Cd含量的质量控制标准，标准物质的回收率为105%～113%。

1.4 土壤DNA提取与测序

采用试剂盒（FastDNA®Spin Kit for Soil，MP，Biomedicals，USA）提取土壤总DNA，DNA溶液的质量和浓度采用NanoDrop 2000（Thermo，美国）进行测定，提取好的DNA样品稀释10倍后于-20℃保存。并提取的基因组DNA为模板，采用16S V4～V5区引物（515F/907R）扩增16S rRNA基因以鉴定细菌群落组成及多样性，高通量测序分析委托上海凌恩生物科技有限公司采用Illumina Hiseq 2500平台进行分析。利用usearch软件（http：//www.drive5.com/usearch/）对所有有效序列进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为操作分类单元OTU（operational taxonomic units），进行Alpha多样性、Beta多样性分析。在门（Phylum）水平上将相对丰度小于1%的细菌类群和无法分类的细菌类群合并在“Others”。

1.5 数据处理与分析

本研究采用SPSS 18.0进行单因素方差（ANOVA）分析比较各处理间的显著性差异；采用Bray-Curtis距离及多变量统计学方法主坐标分析（PCoA，Principal coordinates Analysis）比较不同样品间细菌群落结构差异。

2 结果与分析

2.1 钝化剂对不同水稻品种根际土壤pH和有效态Cd的影响

水稻收获后对不同钝化剂处理下的水稻根际土壤pH和有效态Cd含量进行测定。如图1A所示，与对照处理相比，添加碳酸钙能显著增加水稻根际土壤的pH（P＜0.01），深优957和甬优538水稻根际土pH分别为7.04和6.73，分别比对照处理提高了1.91和1.43。添加生物炭仅显著提高了深优957根际土壤pH，其pH从5.13提高到5.65，但是生物炭的添加对甬优538根际土壤pH未产生显著影响。对所有处理下根际土壤中有效态Cd进行测定发现，添加碳酸钙能极显著降低盆栽土壤中有效态Cd含量（P＜0.01）（图1B），深优957和甬优538水稻根际土壤中有效态Cd含量分别从0.24 mg·kg-1和0.23 mg·kg-1降低到0.05 mg·kg-1和0.08 mg·kg-1，分别降低了79.2%和65.2%。而添加生物炭仅显著降低了深优957根际土壤中有效态Cd含量，降低了27.0%，但是并没有对甬优538根际土壤中有效态Cd含量产生显著影响。

图1 钝化剂处理对水稻根际土壤pH（A）及有效态Cd含量（B）的影响Figure 1 Effects of different passivators on pH（A）and extractable Cd（B）in rhizosphere soil

2.2 钝化剂对不同水稻品种根系、秸秆和籽粒Cd积累的影响

水稻收获后对水稻根系、秸秆以及籽粒中Cd含量进行测定，结果如图2所示。与对照处理相比，添加生物炭和碳酸钙均可以显著降低深优957根系所积累的Cd含量，与对照处理相比分别降低了44.9%和91.8%（图2A）。与对照处理相比，添加生物炭对甬优538根系积累Cd有显著影响，碳酸钙能极显著降低甬优538根系积累的Cd含量（P＜0.01），从50.59 mg·kg-1降低到8.95 mg·kg-1，降低了82.3%。生物炭处理能显著降低深优957秸秆中Cd的积累，而对甬优538秸秆中Cd的积累无显著影响。与对照处理相比，碳酸钙处理均能显著降低两个品种秸秆中Cd的积累，将深优957和甬优538秸秆中的Cd含量分别降低了95.8%和89.6%（图2B）。添加生物炭和碳酸钙均能够显著降低深优957籽粒中Cd含量（P＜0.01），与对照处理相比，添加碳酸钙将深优957籽粒中Cd含量降低了91.8%，添加生物炭将深优957籽粒中Cd含量降低了50.5%（图2C）；碳酸钙处理中甬优538籽粒中Cd含量降低了88.1%，而生物炭处理中甬优538籽粒中Cd含量虽然也有所降低，但差异不显著。碳酸钙处理两个品种水稻籽粒中Cd含量均低于《食品安全国家标准 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）规定的糙米Cd含量0.2 mg·kg-1限定值。对稻米Cd富集系数分析表明，生物炭处理显著降低了深优957籽粒Cd富集系数，而对甬优538籽粒Cd富集系数也有降低作用，但与对照处理相比差异不显著；碳酸钙处理均能显著降低两个品种籽粒Cd生物富集系数，且对籽粒Cd富集系数降低效果优于生物炭处理（图2D）。

图2 钝化剂处理对不同积累型水稻根系（A）、秸秆（B）、籽粒（C）Cd积累和籽粒Cd富集系数（D）的影响Figure 2 Effects of different passivators on roots（A）,shoots（B）,grain（C）Cd accumulation and grain Cd bioconcentration factor（D）in two rice cultivars

2.3 钝化剂对不同水稻品种产量的影响

水稻收获后测定了不同处理下两种水稻的结实率与单株籽粒产量等农艺性状，结果如图3所示。与对照处理相比，不同钝化剂的添加均未对水稻的结实率和单株产量产生显著影响。深优957的结实率集中在66.2%～72.6%之间，单株产量集中在14.5～16.0 g之间；甬优538的结实率集中在65.9%～67.1%之间，单株产量集中在8.9～10.4 g之间。

图3 钝化剂处理对不同积累型水稻结实率（A）和单株产量（B）的影响Figure 3 Effects of different passivators on seed setting rate（A）and yield（B）of two rice cultivars

2.4 钝化剂对不同水稻品种根际细菌群落的影响

2.4.1 对根际土壤细菌群落丰度及多样性的影响α多样性分析中Chao指数和Ace指数用来表征物种的丰富度，Shannon指数和Simpson指数用来表征物种的多样性。Chao指数和Ace指数数值越大，表明微生物群落丰度越高。Shannon指数和Simpson指数数值越大，表明微生物群落多样性和均一性越好。如表1所示，对照条件下深优957根际微生物Ace、Chao、Shannon和Simpson指数均略高于甬优538，其中Ace指数达到显著水平。与对照处理相比，生物炭处理下深优957根际微生物Ace和Chao指数分别降低20.2%和10.0%，而甬优538根际微生物Ace和Chao指数无显著差异；生物炭处理下两个品种根际微生物Shannon和Simpson指数与对照处理相比均无显著差异。碳酸钙处理下深优957根际微生物Ace、Chao、Shannon和Simpson指数与对照处理相比分别降低了24.4%、12.8%、9.8%和4.3%，而甬优538根际微生物Chao、Shannon和Simpson指数与对照处理相比也均显著降低。

表1 钝化剂处理不同Cd积累型水稻根际细菌群落α多样性指标Table 1 Alpha diversity index of bacterial community under different passivators

通过主坐标分析（PCoA）样本间的空间距离表示细菌群落结构的差异程度。结果表明（图4），水稻品种与钝化剂处理显著影响了水稻根际细菌群落结构，解释了54.68%的变异（PCoA1）。此外，对两个品种来说，碳酸钙和生物炭处理均是两种水稻根际细菌变异的主要影响因素，解释了15.37%的变异（PCoA2）。在对照条件下，高、低镉积累品种间存在显著的根际微生物群落差异，但添加碳酸钙或生物炭处理降低了品种间的根际微生物群落差异。

图4 钝化剂处理对不同积累型水稻根际细菌群落主坐标分析Figure 4 Principal co-ordinates analysis of rhizosphere bacterial community of two rice cultivars treated with different passivators

2.4.2 对根际土壤细菌群落组成及群落结构的影响

本研究从3个处理下两水稻品种根际共获取7个相对丰度高于1%的门水平上的细菌类群（图5），分别是变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）和浮霉菌门（Planctomycetes），该7个优势细菌群落，占总细菌群落的70%以上。其中Proteobacteria相对丰度最高，占总细菌群落的54.6%～68.9%；Acidobacteria其次，占总细菌群落的3.5%～14.9%。未添加处理条件下，深优957根际Proteobacteria、Acidobacteria和Actinobacteria丰度显著高于甬优538，而Firmicutes、Chloroflexi、Planctomycetes丰度显著低于甬优538。

图5 钝化剂处理下不同积累型水稻根际细菌群落组成Figure 5 Bacteria community composition in rhizosphere soil of two rice cultivars treated with different passivators

在生物炭处理的样品中，与对照处理相比，深优957根 际Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria丰度分别增加4.1%、1.5%、0.3%，而Acidobacteria和Bacteroidetes丰度分别降低3.7%和3.1%；甬优538根际Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria丰度分别增加11.7%、7.6%、0.8%、1.3%，而Firmicutes和Bacteroidetes丰度分别降低15.0%和6.7%。

在碳酸钙处理的样品中，与对照处理相比，深优957根际Firmicutes、Bacteroidetes、Chloroflexi丰度分别增加8.9%、5.4%、0.8%，而Proteobacteria和Acidobacteria丰度分别降低6.4%和8.9%；甬优538根际Proteobacteria丰度增加12.9%，而Acidobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes丰度分别降低1.9%、7.0%和2.1%。

3 讨论

3.1 不同钝化剂对水稻根际土壤pH和有效态Cd的影响

水稻对Cd的积累与土壤中有效态Cd含量具有显著相关性，因此施用土壤钝化剂后，土壤pH升高，土壤有效态Cd含量降低，是水稻镉积累降低的主要原因之一[14]。3 g·kg-1碳酸钙处理提高土壤pH和降低土壤有效态Cd含量的作用均显著强于生物炭处理。添加10 g·kg-1生物炭仅显著提高了深优957根际土壤pH，并将其土壤中有效态Cd含量降低了27.0%，但是并没有对甬优538根际土壤pH及有效态Cd含量产生显著的影响。这可能与不同镉积累型水稻品种根系形态与根系分泌物的差异有关。一方面，有研究表明不同水稻品种根系分泌的有机酸含量具有显著差异，且受外界Cd胁迫的影响[15]。本研究中Cd高积累水稻品种根系分泌物的酸化作用能够增加根际土壤中H+含量，从而降低根际土壤pH值，而添加生物炭能够提高土壤pH值，当生物炭添加量为1%时，二者作用可能相互中和抵消，从而导致其提高pH的效果不显著。另一方面，有研究表明高镉积累水稻品种根长、根表面积和根体积均显著高于低镉积累品种[16]，因此提升相同单位根际pH值所需生物炭量，高积累品种要高于低积累品种。此外，碳酸钙处理下，高积累水稻品种根际土壤有效态Cd含量依然显著高于低积累品种根际土壤有效态Cd含量（图1B），这也表明水稻根际土壤有效态Cd含量不仅与土壤pH值有关，而且与水稻品种有关。高镉积累型水稻品种具有更大的根表面积，更大的根表面积可以通过细胞壁中的果胶吸附结合更多的Cd[16-17]。而高镉积累品种根系细胞壁对Cd的吸附-解吸作用可能是造成相同钝化剂处理下高镉积累品种根际土壤有效态Cd含量高于低镉积累品种根际土壤有效态Cd含量的原因[18]。

3.2 不同钝化剂对高低镉积累水稻品种Cd积累的影响

本研究三种处理中，碳酸钙处理对两个水稻品种根系、秸秆以及籽粒中Cd含量降低效果均最为显著（P＜0.01），分别将深优957和甬优538根系、秸秆以及籽 粒 中Cd含 量 降 低 了91.8%和82.3%、95.8%和89.6%以及91.8%和88.1%，降低效率均在80%以上。其中，碳酸钙处理下深优957和甬优538籽粒中Cd含量分别为0.09±0.01 mg·kg-1和0.15±0.03 mg·kg-1，均低于国家食品安全标准糙米中Cd限量指标0.2 mg·kg-1（GB 2762—2017）。有研究表明，稻米Cd含量与土壤pH值呈极显著相关，将土壤pH值调控到6.5以上是降低稻米中Cd含量的有效途径[19-20]。本研究利用碳酸钙将土壤pH值调控到6.5以上具有显著降低水稻籽粒Cd积累的效果，这与前人研究结果一致[21]。也有研究表明，生物炭不仅通过提高土壤pH降低土壤Cd的有效性，而且通过表面的物理吸附和化学作用对土壤Cd进行钝化，降低土壤中Cd的有效性[22-23]。本研究中添加10 g·kg-1生物炭仅显著降低了深优957根系、秸秆以及籽粒中的Cd含量，和对照处理相比分别降低了47.1%、41.3%以及50.5%，但对甬优538根系、秸秆以及籽粒中Cd含量并未产生显著影响，表明生物炭对水稻的降Cd效果受到不同镉积累型水稻品种的影响。已有研究表明根际溶液中的Cd主要通过水稻根系表皮细胞膜上锰、铁、锌等二价金属离子转运蛋白进入水稻体内[24]，且不同水稻品种对Cd的吸收积累存在广泛的遗传变异[7]，不同镉积累型水稻根系表皮细胞膜上Cd转运蛋白的表达量高低和对Cd的亲和力强弱差异可能是导致钝化剂对不同镉积累型水稻降Cd作用差异的主要原因之一。此外，生物炭和碳酸钙粉中的Cd含量均超过0.1 mg·kg-1，而本次盆栽试验中碳酸钙粉的用量远低于生物炭的用量，这也可能是碳酸钙处理的降Cd效果优于生物炭处理的原因之一。

对照处理下，深优957籽粒中Cd含量为0.87 mg·kg-1，比甬优538籽粒中Cd含量低了33.1%，但仍然具有较高的Cd积累量。这与土壤中Cd浓度以及有效性有关，也与水分管理模式有关，本次盆栽试验为了更加明确体现出不同处理下的降Cd效果，在水稻扬花时就采用了湿润灌溉模式，即土壤表面无淹水仅保持土壤湿润，这会导致水稻吸收积累更多的Cd[21，25]。也有研究者指出，湿润灌溉模式下Cd从水稻秸秆向籽粒中迁移的转运系数会比淹水灌溉模式的转运系数提高64.3%[26]。另外，和对照处理相比，添加生物炭和碳酸钙均未对深优957和甬优538的结实率、单株产量产生明显影响，说明本研究中两种钝化剂处理措施在实际生产中具有较好的应用潜力。

3.3 不同钝化剂对高低镉积累品种根际细菌群落的影响

为进一步探讨不同土壤钝化剂对水稻根际细菌群落的影响，分析了根际细菌群落结构的变化。本研究发现低镉积累型水稻深优957根际细菌群落丰度显著高于高镉积累型水稻甬优538（P＜0.05），而两个品种间根际细菌多样性并无显著差异，这一方面表明低镉积累型水稻根际细菌数量多、代谢活性更强，另一方面也表明不同镉积累型水稻根系分泌物种类和数量存在差异。细菌群落α多样性分析表明，生物炭处理降低了低镉积累品种深优957根际细菌群落丰度，但对根际细菌多样性无显著影响，生物炭对高镉积累品种甬优538根际细菌群落丰度与多样性均无显著影响。生物炭处理对土壤微生物的影响是复杂且变化的，并且与生物炭的应用时间、类型和数量密切相关[27-28]。碳酸钙处理均显著改变了两个品种水稻根际细菌群落丰度和多样性。总体而言，碳酸钙处理对水稻根际微生态环境的影响相对较大。

在门水平上，不同处理下高低镉积累型水稻根际优势菌门一致，这些优势菌门在重金属污染土壤中分布广泛[29-30]。与对照处理相比，生物炭处理两个品种水稻根际Proteobacteria和Chloroflexi的丰度均显著增加。Proteobacteria作为革兰氏阴性菌，其特征是细胞壁外存在一层能将金属从细胞外分离的脂多糖层，从而可以适应恶劣的污染环境[31]。Chloroflexi是一类以CO2为碳源通过光合作用产生能量的细菌[32]，该菌门丰度与土壤重金属含量呈负相关，因此该菌群属于重金属敏感菌群[33-34]。本研究结果表明添加生物炭能调节根际微生物群落结构进而抵御恶劣的环境污染。有研究表明，Acidobacteria和Actinobacteria在土壤中的丰度与有效态重金属含量呈正相关，Acidobacteria和Actinobacteria的存在有利于植物对重金属的吸收[35]。本研究中添加碳酸钙均显著降低了高、低镉积累型水稻根际Acidobacteria和Actinobacteria的相对丰度，表明水稻根际Acidobacteria和Actinobacteria这两类细菌类群丰度对水稻根际有效态Cd含量具有潜在指示作用。

4 结论

（1）施用碳酸钙对于高、低镉积累型水稻籽粒镉积累均有较好的阻控效果，而施用生物炭在不同镉积累特性水稻品种间的阻控效果存在差异；碳酸钙阻控水稻镉积累的效果优于生物炭，且用量少，成本低。

（2）不同镉积累型水稻品种的根际细菌群落结构存在显著差异，而生物炭和碳酸钙处理减少了不同镉积累型水稻之间根际细菌群落结构的差异，此外，碳酸钙处理降低了水稻根际细菌群落丰度和多样性，实际应用中可结合有机物料施用，以降低对根际土壤微生物群落的影响。