藤龙补中汤对大肠癌荷瘤小鼠免疫功能的影响※

黄晓伟 王双双 郑佳露 陈 雷 彭 骁 陈锦芳 安红梅 胡 兵△

(1．上海中医药大学附属龙华医院中医肿瘤研究所，上海 200032；2.上海中医药大学基础医学院，上海 201203；3.上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科，上海 200032； 4.上海中医药大学附属龙华医院科技处，上海 200032)

中医药在大肠癌的治疗中发挥了重要作用，根据大肠癌的临床表现，将其归为中医学积聚、脏毒、肠覃等范畴。我们在临床实践基础上，以解毒、利湿、健脾立法，研发了治疗大肠癌的抗癌中药复方藤龙补中汤(专利号：ZL200910197565)，现代药理研究证实，藤龙补中汤可调控多基因表达，抑制大肠癌生长和转移，并改善患者免疫功能[1-7]。我们通过动物实验观察藤龙补中汤提取物对大肠癌荷瘤小鼠免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性BALB/c小鼠30只，6周龄，体质量(18±2)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2017-0005。饲养于复旦大学实验动物中心SPF级动物房(伦理号：202112025Z)，所有小鼠自由饮水。

1.2 主要试剂 小鼠大肠癌CT26细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)；RPMI1640培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)；复方斑蝥胶囊(贵州益佰制药股份有限公司，国药准字Z52020238)；无菌水溶解藤龙补中汤提取物(上海中医药大学药学院制备[8])；干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素12(IL-12)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(英国Abcam公司)；小鼠CD3、CD4、CD8、自然杀伤(NK)细胞1.1及其同型抗体(美国BD生物科学公司)；红细胞裂解液(碧云天生物技术有限公司)；磷酸缓冲液(瑞典Medicago公司)。

1.3 皮下移植瘤模型制备及干预 所有小鼠饲养1周后进行CT26细胞皮下注射。CT26细胞常规培养，胰酶消化、计数，用磷酸缓冲液调整细胞浓度至1×107个/mL，取细胞悬液，无菌操作于每只小鼠皮下注射细胞悬液0.1 mL，待肿瘤生长至可测量范围时，即为造模成功。按照随机数字表法分为对照组、复方斑蝥胶囊组和藤龙补中汤组，每组10只，分别予无菌水、复方斑蝥胶囊195 mg/kg和无菌水溶解藤龙补中汤提取物2.56 g/kg灌胃，每次0.2 mL，每日1次，共15 d。均予饲料，自由饮用无菌水，灌胃结束后取血、处死小鼠，称量脾、胸腺质量，按公式计算脏器指数。脏器指数=脏器质量(mg)/体质量(g)×10。

1.4 免疫细胞检测 小鼠处死前，每组取3只小鼠，通过眼眶取血，取150 μL抗凝血至离心管中，加入2%牛血清白蛋白溶液10 μL，混匀，室温封闭10 min，同型对照组加入CD3、CD4、CD8同型抗体20 μL或NK1.1同型抗体2 μL，待测样品加入CD3、CD4、CD8抗体20 μL或NK细胞1.1抗体2 μL，室温孵育20 min，加入红细胞裂解液1.2 mL，室温避光裂解2 min，至澄清透明，将上样管以1600 r/min离心6 min，弃上清液，然后再加入磷酸缓冲液2 mL，轻微震荡混匀，离心6 min，弃上清，重复洗2次，加入0.9%氯化钠注射300 μL中，重悬细胞，流式细胞仪(DxFLEX型，Beckman)上机检测CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和NK细胞。

1.5 细胞因子检测 小鼠处死前，每组取4只，小鼠取100 μL血清加入冰浴上的酶标包被板孔里，4 ℃轻摇过夜，倒出液体，1 × 洗涤液洗涤4次，加1×检测抗体100 μL，室温轻摇1 h，倒出液体，1 × 洗涤液洗涤4次，加1 × 辣根过氧化物酶标记链霉亲和素100 μL,室温轻摇45 min，倒出液体，1 × 洗涤液洗涤4次，加底物100 μL，室温避光孵育30 min，加终止液50 μL，酶标仪(Synergy HTX型，BioTek)450 nm检测辅助型T淋巴细胞1(Th1)型细胞因子IFN-γ、IL-12光密度，结果以对照组倍数表示。

2 结果

2.1 3组脾指数、胸腺指数比较 复方斑蝥胶囊组、藤龙补中汤组脾指数、胸腺指数均高于对照组(P<0.05)；藤龙补中汤组胸腺指数高于复方斑蝥胶囊组(P<0.05)；复方斑蝥胶囊组与藤龙补中汤组脾指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组脾指数、胸腺指数比较

2.2 3组免疫细胞比较 复方斑蝥胶囊组、藤龙补中汤组CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞、NK细胞均高于对照组(P<0.05)；藤龙补中汤组CD4+T淋巴细胞低于复方斑蝥胶囊组(P<0.05)，藤龙补中汤组CD8+T淋巴细胞、NK细胞均高于复方斑蝥胶囊组(P<0.05)；复方斑蝥胶囊组与藤龙补中汤组CD3+T淋巴细胞比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组免疫细胞比较

2.3 3组Th1型细胞因子比较 复方斑蝥胶囊组、藤龙补中汤组IFN-γ、IL-12均高于对照组(P<0.05)；藤龙补中汤组IFN-γ、IL-12均高于复方斑蝥胶囊组(P<0.05)。见表3。

表3 3组Th1型细胞因子比较

3 讨论

藤龙补中汤由藤梨根、龙葵、蛇莓、白术、茯苓、薏苡仁、半枝莲、槲寄生组成，其中藤梨根、龙葵解毒利湿，蛇莓解毒抗癌，白术、茯苓、薏苡仁健脾利湿，半枝莲、槲寄生协同抗癌，全方共奏解毒、利湿、健脾功效。前期研究显示，藤龙补中汤可抑制大肠癌肿瘤生长和转移，诱导细胞衰老和凋亡，调节免疫功能[1-3]。现代药理研究表明，龙葵多糖可提高荷瘤小鼠胸腺指数，升高IFN-γ，增加T淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞在肿瘤组织的浸润[9-10]。白术多糖可激活T淋巴细胞[11]，升高CD4+和CD8+T淋巴细胞[12]。茯苓可升高IL-2和IFN-γ，调节免疫功能[13-14]。薏苡仁可升高IFN-γ、IL-2，提高CD4+T淋巴细胞，改善细胞免疫功能[15-16]。

参与抗肿瘤免疫的T淋巴细胞主要包括CD4+和CD8+。CD4+由胸腺来源Th0 细胞在IL-12的作用下分化为Th1细胞，进而分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，激活CD8+细胞毒T细胞(CTL)执行抗肿瘤免疫；也可在IL-4作用下分化为Th2细胞，分泌IL-4、IL-5等细胞因子，参与体液免疫调控[17]。NK细胞是抗肿瘤固有免疫的主要细胞群体，可非特异杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的重要细胞[18-19]。

本研究结果显示，藤龙补中汤可升高大肠癌荷瘤小鼠脾指数、胸腺指数，提高外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞和NK细胞，同时升高IL-12、IFN-γ水平，提示藤龙补中汤可改善大肠癌荷瘤小鼠免疫功能，激发Th1型免疫反应。