动静脉夹闭在创伤性脑损伤大鼠脑组织固定中的应用效果

杨家发，朱义通，陆兆丰，王亚琼，陆若玉，李海荣，刘梦佳

(1.河南科技大学第一附属医院 河南 洛阳 471003；2.上海交通大学 公共卫生学院，上海 200001)

创伤性脑损伤是死亡和残疾的主要原因之一，是一个国际公共卫生问题[1]。为了深入了解脑外伤的机理，研究人员已经建立了一些实验动物模型，自由落体诱导的创伤性脑损伤模型可以产生分级脑损伤和诱发神经行为缺陷，并可能与开发创伤性脑损伤的治疗策略有转化相关性[2]。血脑屏障的测量对于研究血脑屏障功能障碍或破坏与脑障碍发病机制之间的相互作用具有重要意义。应采用适当的方法研究血脑屏障的完整性。示踪剂、血浆蛋白、紧密连接蛋白和成像模式可用于检测血脑屏障的通透性[3-4]。

在脑组织病理学实验研究中，需在体心脏灌注固定脑组织，实验动物在体心脏灌注被广泛应用于组织固定，心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象，是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。因此，本研究拟建立闭合性中等程度脑损伤动物模型，通过股动静脉穿刺置管静脉注射伊文斯兰染色，暴露胸腔，同时夹闭下腔动静脉腹主动脉，行左心室心脏灌流，探讨动静脉夹闭在大鼠创伤性脑损伤后脑组织在体心脏灌流固定术中的应用效果。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组36只4月龄无特定病原级雄性Sprague Dawley大鼠购自河南科技大学实验动物中心，体质量306～335(320.05±11.14)g；随机分为对照组及实验组，每组18只，饲养于12 h/12 h明暗交替环境，温度保持在25 ℃；术前12 h禁食，6 h禁水。

1.2 主要试剂及器械肝素(成都市海通药业有限公司)，注射用盐酸替来他明盐酸唑拉西泮(苏泰®50)(上海化学试剂分装厂)，40 g·L-1多聚甲醛灌注液(四川科伦药业股份有限公司)，9 g·L-1氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司)，带有LED灯普通放大镜(浙江安普机械有限公司)，24G针管回缩式静脉留置针(24G×19 mm，山东威海锐捷医用制品有限公司)。脑立体定位仪(深圳瑞沃德双臂/大鼠/68078/18度耳杆)，环钻(江苏赛德器械有限公司)。

1.3 麻醉及创伤性脑损伤模型实验时用注射用盐酸替来他明盐酸唑拉西泮(苏泰®50)50 mg·kg-1腹腔注射后俯卧于脑立体定位仪上，颈部垫圆柱形海绵垫抬升头部确保顶骨充分暴露。固定后额顶部剃毛、消毒，铺手术创巾，正中切开，剥离骨膜，暴露右顶骨，用环钻在冠状缝后1.5 mm，中线旁2.5 mm处钻一直径7 mm骨窗，保持硬脑膜完整。将直径6 mm 3.5 g钢棒从滴定管架固定内径7 mm聚氯乙烯透明管70 cm自由下落，撞击硬脑膜致中度脑挫裂伤，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。建模成功后用电热毯维持大鼠肛温于(36.5±0.5)℃。放笼饲养。

1.4 股静脉穿刺置管建模24 h后注射用盐酸替来他明盐酸唑拉西泮(苏泰®50)50 mg·kg-1腹腔注射后仰卧于显微实验台上，剃去腿部内侧区域的毛发，使用医用碘伏擦洗，擦洗从中心开始的剃光的手术区域，并向外进行圆形消毒。对每个区域重复3次。左侧腹股沟中外1/3与股静脉交叉口外1 cm平行股鞘切开皮肤，钝性分离筋膜，显露股静脉，在LED放大镜下，用24G针管回缩式静脉留置针穿刺，回抽，见回血后，肝素注射，回抽；对照组用24G针管回缩式静脉留置针穿刺，步骤与对照组相同。

1.5 心脏灌流固定术对照组和实验组24 h后股静脉穿刺注射20 g·L-1伊文斯兰3 mL·kg-1，术后1 h在麻醉状态下暴露胸腔，剪开心包，在左心室剪开小口，插入灌流针并固定，实验组同时夹闭下腔动静脉腹主动脉，同时在右心耳剪开小口，对照组和实验组左心室灌注9 g·L-1氯化钠注射液，直至右心耳流出液清亮为止，以清除血液中染料，对照组和实验组缓慢灌注40 g·L-1多聚甲醛，断头取脑迅速浸入体积分数为10%的甲醛溶液150 mL固定1 h，石蜡包埋，行5 μm冠状切片，进行HE染色及免疫组化染色。

2 结果

2.1 灌注成功指标前肢、后肢、腹部、尾部肌肉剧烈抽动；肝脏、眼珠、爪子迅速变白(实验组肝脏蓝染)；右心耳流出液体蓝色较浅基本清亮。

2.2 固定成功指标前肢、颈部、脊柱、尾部僵硬；灌注的脑组织白而硬(实验组损伤区蓝染)。灌注或固定不足在病理切片表现为组织疏松，镜下组织分离，容易产生破片、脱片。

2.3 统计学指标选取股静脉穿刺置管成功大鼠静脉注射伊文斯兰，实验组及对照组股静脉穿刺置管成功15只，行脑组织灌注固定，实验组和对照组灌注成功率分别为93.33%(14/15)和80.00%(12/15)，差异有统计学意义(P=0.042)。见表1。

表1 两组统计指标

2.4 灌流固定脑组织HE和免疫组化染色观察HE染色：不同程度基质疏松，细胞周围间隙和血管周间隙轻度扩大，星形胶质细胞肿大，神经元核固缩、胞体收缩呈三角形，胞质嗜色性减弱，核皱缩浓染(图1)。免疫组化染色：β-淀粉样前体蛋白、胶质纤维酸性蛋白在神经元浆膜下和(或)轴突处积累，免疫组织化学染色呈棕染。

A为实验组，B为对照组。弥漫性出血性改变，神经元体积常缩小，胞膜与周围无明显分界，胞核固缩，正常结构及核仁皆消失。

3 讨论

创伤性脑损伤是造成死亡、残疾和精神健康障碍的主要原因之一。大多数创伤性脑损伤患者有长期创伤后应激障碍、认知障碍和残疾。这种神经病理进展的潜在分子和细胞机制仍不清楚。各种脑外伤动物模型对轻、中、重度损伤的分类界限不清与创伤性脑损伤异质性有关。因此，更好的诊断和治疗需要更好地理解不同模型中明确的轻、中、重度损伤的损伤机制，这些模型可能反映了不同类型的人类脑损伤。局灶性损伤是一种局域性损伤，表现为控制性皮层损伤、弹道穿透性脑损伤和Feeney或Shohami自由落体损伤等动物模型[5]。大鼠自由落体损伤模型模拟了人类严重创伤性脑损伤引起的弥漫性轴索损伤(difffuse axonal injury，DAI)。重度控制性皮质撞击模型的运动功能障碍更为严重，重度自由体质量下降模型的认知障碍更为严重。与重度自由体质量下降组相比，重度对照皮质撞击组的脑水肿、炎症细胞因子改变和皮层神经元凋亡更为明显，血脑屏障损伤更为局灶性[6]。而组织灌注固定的质量决定了DAI抗体准确检测其表达位置和量。

创伤性脑损伤动物模型建立和应用研究中，尚缺乏统一的、与临床创伤性脑损伤患者格拉斯哥昏迷量表或格拉斯哥预后评分类似的量化评分系统，以评估动物创伤性脑损伤后损伤程度及预后评估，部分学者通过结合伤后大鼠血清中脑损伤标志物评估脑损伤程度[7]。通过脑血管系统灌注固定剂是动物准备脑组织用于空间生物分子谱、回路追踪和超微结构研究(如连接组学)的金标准方法。脑灌注固定已经在动物模型中进行了几十年，作为一种更稳健和可靠的方式保持组织完整性的方法。人类脑组织灌注固定方法的改进将使人类大脑疾病病理生理学的新研究成为可能，如高分辨率的体外神经成像、空间生物分子图谱、回路追踪和连接体研究。灌注固定是一种适用于更高质量的深部结构固定和可能提高免疫原性的方法[8]。

通过循环系统直接灌注固定剂的优点是这种化学物质可以利用天然的血管网络迅速到达生物体的每一个角落。灌注固定的技术取决于要固定的组织以及固定后组织的处理方式。低成本、快速、可控和统一的固定过程，使用40 g·L-1多聚甲醛通过血管系统灌注：通过大鼠的心脏，以获得免疫组化中大脑的最佳保存。这种技术的主要优势(与重力输送系统相比)是循环系统被最有效地利用[9]。

最适灌注压影响灌注固定保存的脑组织中血管和组织的完整性[10-12]。在保证最适灌注压基础上，减少不必要灌注容积，既可以提高灌注成功率，又可以缩短灌注固定时间，为建立稳定可靠、简便易行、可重复性的创伤性颅脑损伤动物模型奠定基础。研究显示大鼠上肢及颈部循环在脑灌注固定中占据重要作用，下肢及腹腔循环夹闭后，效果明显，通过股静脉穿刺，静脉注射伊文斯兰，上肢及下肢经灌注后，相较传统无染色灌注，效果差异明显，脑组织病理结果是评价灌注固定效果及其染色效果的一项指标。夹闭法相较传统灌注固定法优点在于：(1)操作简单，手术时间短，常规暴露心脏，提起心包外膜，止血钳夹闭下腔动静脉，在心尖搏动点剪开小口，插入改进型灌胃器，固定，即可灌注；(2)灌注压相对低，手术保留头颈部及前肢动静脉系统，去除下腔动静脉系统，较低的灌注压即可达到效果；(3)适用于大动物模型，大动物脏器相较大鼠解剖标志模型，夹闭法仍然适用。

总之，动静脉夹闭在创伤性脑损伤大鼠脑组织固定中能提高灌注成功率，缩短灌注时间，节约试剂，且可以取得与传统方法固定脑组织相同的良好效果，值得推广应用。