豇豆中5种农药及其代谢物残留检测与膳食风险评估

张 群 段 云 马 晨 田 海 郇志博 吴晓鹏

〔中国热带农业科学院分析测试中心，农业农村部亚热带果品蔬菜质量安全控制重点实验室，海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室，农业农村部热作产品质量安全风险评估实验室（海口），海南海口 571101〕

豇豆〔（Linn.）Walp.〕又名带豆、豆角等，广泛生长于热带、亚热带地区，嫩荚可炒食、凉拌、泡食或腌渍晒干食用，种子可代粮和做馅料，营养丰富，是海南省大宗瓜菜种类之一，也是冬季重要的反季节瓜菜种类，海南省年栽培面积约133.33 万hm，总产量25 万t 左右（张群 等，2021）。豇豆为连续采收作物，花期和收获期并存，病虫害爆发几率更高。农业农村部热作产品质量安全风险评估实验室（海口）调研发现，海南省豇豆生产中灭蝇胺和多菌灵的使用频率非常高。吕岱竹等（2018）研究表明，灭蝇胺是海南省豇豆防治斑潜蝇的主要用药之一，且灭蝇胺残留易超标；李祖莅和袁伟方（2017）研究表明，多菌灵可用于防治豇豆枯萎病；此外，氟虫腈、克百威、涕灭威是对人体健康存在高风险的禁限用农药（王连森 等，2016）；因此，这些农药常被列为蔬菜农残的监测对象（龚久平 等，2018）。

国内外普遍关注农产品中农药残留问题，但对农药代谢产物的研究较少。灭蝇胺在植物体内可通过脱烷基作用代谢为三聚氰胺（王京文 等，2011；Liu et al.，2015），其对动物及人体造成肾衰竭从而有害健康（孙贵朋 等，2008）。多菌灵虽被划分为低毒农药，但越来越多的研究表明多菌灵易对动物、植物、浮游生物、土壤微生物及人类健康产生危害（魏中华 等，2015；Jiang et al.，2015；徐信燡和施春雷，2019）。2-氨基苯并咪唑是多菌灵在植物体内降解代谢的主产物，其短期毒性与母体多菌灵相同，但是急性毒性更严重（郝露露，2013；刘超 等，2018）。我国食品安全国家标准GB 2763—2021《食品中农药最大残留限量》中规定了涕灭威、氟虫腈和克百威的残留物检测标准：以涕灭威及其氧类似物（砜、亚砜）之和表示涕灭威；氟甲腈、氟虫腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈砜之和表示氟虫腈；克百威及3-羟基克百威之和表示克百威。近年来，关于灭蝇胺、多菌灵、涕灭威、氟虫腈、克百威这5 种农药及其代谢物的检测方法主要有气相色谱法（司富美 等，2019；张春萍 等，2020）、液相色谱法（金晓峰 等，2020；吴新华 等，2020）、光谱分析法（吴凤莲，2019）、免疫分析法（蒋文慧 等，2021）和电化学传感器技术（Cui et al.，2017）等，以具有灵敏度高和分析速度快的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）为主。

目前，测定农作物农药残留的UPLC-MS/MS方法比较成熟，但是农药代谢物残留检测方法的报道较少。QuEChERS 法是一类快速、简便、经济、高效、耐用和安全的样品前处理方法，常用于植物产品器官农药残留检测。本试验采用QuEChERS技术进行样品前处理，通过优化色谱-质谱条件，建立了一次同时提取、正负离子模式同时测定豇豆中5 种农药及其代谢物含量的检测方法，并利用该方法对海南省市售豇豆样品进行检测分析，初步评估了豇豆中所检出农药的慢性和急性膳食摄入风险情况，以期为保障人体健康提供技术和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豇豆购于海南市场，采样时间为2020 年11 月至2021 年2 月，采样地点为三亚、乐东、澄迈、陵水、儋州、海口，采样量为238 份。取豇豆鲜样1 000 g，经高速匀浆机匀浆后混匀，装入洁净的密封罐中，标明编号，于-20 ℃保存。1 个月内完成样品检测，检测地点为农业农村部热作产品质量安全风险评估实验室（海口）。

试验用到的标准物质灭蝇胺、多菌灵、氟虫腈、克百威、涕灭威、三聚氰胺、2-氨基苯并咪唑、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫醚、3-羟基克百威、涕灭威砜、涕灭威亚砜均购于农业部环境质量检验测试中心（天津），纯度≥ 99%。甲醇、乙腈购于美国Fisher 公司，HPLC 级；乙酸铵购于广州化学试剂厂，分析纯。分散SPE 试剂盒（2 mL，150 mg MgSO、25 mg PSA、2.5 mg GCB）、萃取盐包（0.5 g 半水柠檬酸氢二钠、1 g 二水合柠檬酸三钠、1 g NaCl、4 g MgSO）购于Agilent公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC-MS/MS）（TRIPLE QUAD6500）为美国SCIEX 公司生产，电子天平（EB-280-12）为日本岛津公司生产，去离子水纯化系统（Milli-Q）为美国Millipore 公司生产，高速匀浆机（T25 basic）为广州仪科实验技术有限公司生产，离心机（TGL 16M）为湖南凯达科学仪器有限公司生产，旋涡混合器（QL-901）为江苏海门其林医用仪器厂生产。

1.3 试验方法

1.3.1 超高效液相色谱条件 采用ACQUITY UPLCBEH C色谱柱（Waters 公司，2.1 mm × 50 mm，1.7 μm），选用3 种流动相，分别为：A 相为乙腈、B 相为1.0 mmol·L乙酸铵水溶液，A 相为乙腈、B 相为超纯水和A 相为甲醇、B 相为1.0 mmol·L的乙酸铵水溶液。柱温40 ℃，进样量1 μL，流动相的梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.3.2 质谱条件 检测模式：多反应监测模式（MRM）；电离方式：正离子扫描（ESI）、负离子扫描（ESI）；气帘气：40 psi；碰撞气：8 psi；离子喷雾电压：5 500 V；离子源温度：550 ℃。通过优化定量、定性离子对的碰撞能量和锥孔电压，得到优化后的化合物质谱参数见表2。

表2 5 种农药及其代谢物的质谱条件

1.3.3 样品处理 称取10.00 g 豇豆样品（精确至0.01 g），放置于50 mL 离心管中，加入20.0 mL 乙腈，在旋涡混合器上以2 500 r·min的速率振荡3 min，之后在萃取管中加入萃取盐包并涡旋2 min，萃取管在4 000 r·min条件下离心5 min，使水相和乙腈相分离。将1.8 mL 上清液转移至含分散SPE 试剂的2 mL 净化管中，在旋涡混合器上以2 500 r·min的速率振荡3 min，然后将净化管在10 000 r·min条件下离心5 min。分别取净化后的1 mL 上清液与1 mL 超纯水在5 mL 聚丙烯离心管中混合均匀，经有机系微孔滤膜（天津市津腾实验设备有限公司，50 mm/0.22 μm）过滤后待仪器检测。

1.3.4 标准溶液与混合基质标准溶液的配制 标准溶液配制：分别用甲醇溶解5 种农药及其代谢物，配制成浓度为100 mg·L的标准储备液，-20 ℃冷冻避光保存。

混合基质标准溶液配制：将豇豆空白样品（未检出待测化合物的样品）按1.3.3 中样品处理方法配制成空白基质溶液，用空白基质溶液将标准储备液稀释成浓度分别为100、75、50、25、10、5、1 μg·L的定量标准品混合溶液，现配现用。

1.3.5 加标回收试验 分别称取3 组豇豆空白样品（未检出待测农药及其代谢物的样品）10.00 g，每组5 个重复。在豇豆空白样品中分别添加浓度水平为10、25、50 μg·kg的标准溶液，按照上述方法进行分析检测并计算添加回收率。

1.4 数据分析

1.4.1 基质效应 基质是指样品中除分析物外的其他成分，基质成分的存在对分析结果产生干扰，可以通过计算基质效应（matrix effect，ME）来表示受基质的干扰程度（乐渊 等，2020）。

式中，ME 为基质效应，为化合物在豇豆混合基质标准溶液中校正曲线的斜率，为化合物在标准溶液中校正曲线的斜率。ME=0，表示不存在基质效应；ME ＜0，表示分析物受基质影响为抑制效应；ME ＞ 0，表示分析物受基质影响为增强效应；ME ＜-50%或ME ＞ 50%，表示受基质干扰程度强烈；-50% ≤ ME ＜-20%或20%＜ME ≤ 50%，表示受基质干扰程度中等；-20% ≤ME ≤ 20%，表示受基质干扰程度较低。

1.4.2 膳食摄入风险评估 慢性膳食摄入风险评估是基于整个生命周期的暴露方式，通常以膳食中可能涉及的所有食物中农药残留量的平均值或中位值进行计算；急性膳食摄入风险评估是基于1 餐或1 d 内的膳食摄入量，一般可考虑采用1 种食品中农药的MRL 值进行计算（马晨 等，2021）。

式中，表示农药残留中位值（中位值为一组数据中间位置的数据或中间两位数据的平均值）；表示我国居民豇豆的日平均摄入量（表3）；表示我国不同年龄、性别组人群的平均体重（表3）；表示每日允许摄入量（GB 2763—2021）。

式中，表示最高残留量；表示大份餐，指某类食物1 餐的最大消费量，一般以日消费量的97.5 百分位点值为准，表示以可食部分计的单个产品的质量，参考WHO 全球环境污染物监测规划/食品污染监测与评估项目（GEMs/Food）的数据（https：//cdn.who.int/media/docs/default-source/foodsafety/gems-food/iesti_calculation21_dataoverview.xlsx?sfvrsn=ec9f2eb1_7），取最大值为0.388 2 kg·d，为0.019 4 kg·d；为变异因子，表示一批产品中不同个体或同一个体中不同部位的残留变异，一般取3；表示我国不同年龄、性别组人群的平均体重（表3）；表示急性参考剂量（联合国粮农组织与世界卫生组织联席会议报告https：//www.fao.org/fileadmin/templates/agphome/documents/Pests_Pesticides/JMPR/JMPR05report.pdf；联合国粮农组织与世界卫生组织联席会议报告，https：//www.fao.org/fileadmin/templates/agphome/documents/Pests_Pesticides/JMPR/JMPRreport2006.pdf）。

表3 我国不同年龄、性别组人群的平均体重及豇豆日平均摄入量（吴永宁和李筱薇，2015）

风险程度判定标准（吴永宁和李筱薇，2015）：＜ 50%时无风险，50%～100%时摄入安全但有潜在风险，＞ 100%时存在风险，＞ 150%时存在较大风险，＞ 200%时存在很大风险。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

比较不同的流动相：A 相为乙腈、B 相为1.0 mmol·L乙酸铵水溶液；A 相为乙腈、B 相为超纯水和A 相为甲醇、B 相为1.0 mmol·L乙酸铵水溶液对化合物出峰情况的影响。结果表明：以A相为乙腈、B 相为超纯水时，2-氨基苯并咪唑、三聚氰胺和涕灭威亚砜不出峰；以A 相为乙腈、B 相为1.0 mmol·L乙酸铵水溶液时，灭蝇胺、氟虫腈硫醚、氟甲腈的峰分离度不好；以A 相为甲醇、B 相为1.0 mmol·L乙酸铵水溶液时，在MRM 模式下，5 种农药及其代谢物混合基质标准溶液（50 μg·L）的定量、定性离子对的色谱图如图1～5所示，各化合物的峰形尖锐、分离度高，识别度强。

图1 灭蝇胺及其代谢物三聚氰胺的标准色谱图

图2 多菌灵及其代谢物2-氨基苯并咪唑的标准色谱图

图3 克百威及其代谢物3-羟基克百威的标准色谱图

图4 氟虫腈及其代谢物氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫醚的标准色谱图

图5 涕灭威及其代谢物涕灭威砜和涕灭威亚砜的标准色谱图

2.2 基质效应和方法验证

按1.3.4 所述配制范围在1～100 μg·L内7个浓度梯度的混合基质标准溶液。在1.3.2 的检测条件下，仪器计算的线性方程见表4。结果表明，在1～100 μg·L范围内，线性相关系数均大于0.999，峰面积与进样浓度的线性关系良好。豇豆中灭蝇胺等5 种农药及其代谢物的基质效应见表4。结果表明，灭蝇胺及其代谢物三聚氰胺，多菌灵及其代谢物2-氨基苯并咪唑均表现为基质抑制效应，干扰程度较低。氟虫腈及其代谢物氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈硫醚，克百威及其代谢物3-羟基克百威，涕灭威及其代谢物涕灭威亚砜和涕灭威砜则表现为基质增强效应，除代谢物氟虫腈硫醚、3-羟基克百威和涕灭威砜受中等程度基质干扰外，其他均为较低基质干扰。这些干扰不仅与农药本身结构和仪器离子源结构有关系，也与基质的性质有关。消除基质效应所带来的干扰的方法主要包括同位素内标法、使用分析保护试剂、基质匹配标准溶液和标准添加法等，本试验采用基质匹配标准溶液来消除部分基质带来的影响。

在10、25 μg·kg和50 μg·kg的3 个添加浓度下，豇豆中5 种农药及其代谢物的平均回收率在80.3%～103.1%范围内；相对标准偏差（RSD）范围为1.7%～9.2%，可以满足定量分析要求（表4）。5 种农药及其代谢物的回收率符合NY/T 788—2004《农药残留试验准则》中检测方法开发要求：0.01 mg·kg≤添加浓度≤ 0.1 mg·kg时，平均回收率范围在70%～110%之间，相对标准偏差（RSD）≤ 20%。

表4 验证试验结果（n=5）

通过实际添加回收试验最终确定豇豆中涕灭威及其代谢物涕灭威砜和涕灭威亚砜的定量限为0.010 mg·kg，其他4 种农药及其代谢物的定量限为0.005 mg·kg，平均回收率范围为72.3%～86.3%，相对标准偏差（RSD）范围为6.8%～12.5%。5 种农药及其代谢物的平均回收率符合《农药残留试验准则》中检测方法开发要求：0.001 mg·kg＜添加浓度≤ 0.01 mg·kg时，则60% ＜平均回收率≤ 120%，相对标准偏差（RSD）≤ 30%，本方法的定量限都满足我国、欧盟和日本豇豆中5 种农药的最大残留限量（MRL）检测的要求（表5）

表5 国际规定的5 种农药在豇豆（或豆类）中的最大残留限量值（MRL） mg·kg-1

2.3 实际样品检测

利用该方法测定了海南省2020 年11 月至2021 年2 月共计238 份样品中5 种农药及其代谢物的残留量，阳性样品率为51.7%，其中单独检出多菌灵16 例，单独检出灭蝇胺68 例，检出多菌灵和灭蝇胺混合36 例，灭蝇胺和代谢物三聚氰胺混合1 例，多菌灵、灭蝇胺和代谢物三聚氰胺混合1 例。灭蝇胺的检出率为44.5%，检出浓度范围为0.011～1.221 mg·kg；依据我国现有GB 2763—2021 标准，豇豆上灭蝇胺的MRL 值为0.5 mg·kg，判定豇豆样品中灭蝇胺的超标率为6.3%；灭蝇胺代谢物三聚氰胺的检出率为0.8%，检出浓度范围为0.001～0.009 mg·kg。多菌灵的检出率为22.3%，检出浓度范围为0.009～0.286 mg·kg；鉴于我国目前尚未制定多菌灵在豇豆中的MRL 标准，因此无法计算超标率；参考较为严格的欧盟MRL 标准（0.2 mg·kg），则豇豆样品中多菌灵残留超标率为2.1%。

2.4 膳食摄入风险评估

基于实际样品检测的农药残留中位值计算得到的豇豆中灭蝇胺、多菌灵残留量对不同人群慢性膳食摄入风险范围为0.057 6%～0.131 4%（表6），远小于100%，说明海南省豇豆中农药残留对慢性膳食摄入风险的贡献极小。不同年龄段人群的%ADI值大小符合2～7 岁＞ 8～12 岁＞ 13 岁以上的规律，这是由于2～7 岁、8～12 岁的儿童体重低及摄入量少造成的；除去2～7 岁、8～12 岁两个年龄段，对相同性别不同年龄段人群的%ADI 值进行比较发现，20～50 岁人群的%ADI 值最高，这是由于此年龄段的摄入量与体重比值最高引起的；不同性别、相同年龄段人群的%ADI 值大小符合女性＞男性这一规律，这是由于女性的体重轻于男性导致的。

表6 灭蝇胺、多菌灵在我国不同年龄、性别组人群中的慢性膳食摄入风险

基于实际样品检测的农药残留最大值计算得到的豇豆中灭蝇胺、多菌灵残留量对不同人群急性膳食摄入风险范围为0.375 8%～29.126 6%（表7），小于100%，说明海南省豇豆中农药残留对急性膳食摄入风险处于风险可接受范围内。由于不同年龄、性别组人群中的%ARfD 值与人群的体重成反比，因此2～7 岁年龄段的%ARfD 值最高。

表7 灭蝇胺、多菌灵在我国不同年龄、性别组人群中的急性膳食摄入风险

3 讨论与结论

本试验建立了豇豆中5 种农药及其代谢物快速检测的方法—QuEChERS 法结合超高效液相色谱-串联质谱法。该方法可有效排除基质干扰，定量限可以满足我国、欧盟和日本等国豇豆中5 种农药最大残留限量的检测要求。利用该方法对海南省238 份豇豆样品进行检测，阳性样品率为51.7%，检出农药为多菌灵和灭蝇胺及其代谢物三聚氰胺。利用2020 年11 月至2021 年2 月海南省豇豆主产区豇豆的农药残留量检测数据以及我国居民不同年龄段的豇豆膳食数据对豇豆中灭蝇胺和多菌灵农药残留进行风险评估的研究，结果表明慢性膳食摄入风险很低（%ADI ＜1%），急性膳食摄入风险低（%ARfD ＜30%），表明我国各类人群的灭蝇胺和多菌灵膳食摄入风险是可接受的。2～7 岁儿童的膳食摄入风险明显高于其他年龄段，主要是由于此年龄段的体重较轻引起的。此外，Huan 等（2015）研究表明，漂烫（5 min）是豇豆最安全的家庭加工方式，其次是爆炒（3 min），说明在吃蔬菜前对蔬菜进行加热可以降低农药膳食摄入风险。早在1999 年JMPR 就正式开始对食品中农药残留进行慢性膳食摄入评估，2015 年我国农业农村部开始实施《食品中农药残留风险评估指南》（2308 号公告）（马晨 等，2021）。目前我国的膳食数据尚不完善，本试验的膳食数据参考自《第四次中国总膳食研究》（吴永宁和李筱薇，2015），这项研究是2007 年我国总膳食的全面总结，其中豇豆消费量是根据已有豇豆消费数据（辽宁省、上海市、湖北省和福建省）计算所得，尚缺乏海南省数据，因此可能会随着消费水平的提升而有所变化。本试验基于JMPR 推荐的风险评估方法对豇豆上农药残留的膳食摄入风险进行了评估，但本试验获取的农药残留数据量是有限的，且我国膳食数据不完善，膳食摄入风险评估方法也还存在不确定因素，同时也未考虑农药多残留的联合暴露风险，因此还需一步完善和研究。

在中国农药信息网（http：//www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml）查询灭蝇胺和多菌灵的登记信息，发现灭蝇胺和多菌灵均未在豇豆上登记，其中灭蝇胺有登记用于防治菜豆的美洲斑潜蝇，而多菌灵可防治大豆根腐病。实际情况是这两种农药检出率较高，说明其有一定的需求，故建议种植户在豇豆上合理使用这两种农药，并建议相关部门对这两种农药在豇豆上是否符合农药登记进行评估。我国国家标准对豇豆上多菌灵的最大残留限量无明确规定，建议相关部门制定适合我国国情、科学合理、保障公众健康的限量标准，为风险防控和政府监管提供重要依据。