低温胁迫下不同耐低温性中国南瓜苗期生理差异分析

邱喜岩 段 颖 张 硕 张 蒙 疏 琴 孙雅佩 何亚迪 廖青桂 王长林，2* 薄凯亮*

〔1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业农村部园艺生物学与种质创制重点实验室，北京 100081；2 中蔬生物科技（寿光）有限公司，山东寿光 262700〕

中国南瓜（Duch.）具有适应性强、根系发达等特点，常被用作嫁接砧木，可以提高西瓜、黄瓜等重要葫芦科作物的抗病性和抗逆性。尤其在北方保护地黄瓜生产中，以南瓜为砧木进行嫁接栽培已被广泛应用。大量研究证明，使用耐低温性强的砧木可有效提高嫁接苗对低温胁迫的耐受性（Aloni et al.，2010；Schwarz et al.，2010）。因此筛选耐低温中国南瓜种质资源，培育耐低温的新品种，是砧用南瓜的重要育种目标之一。

低温胁迫严重影响蔬菜的产量和品质，是制约北方冬春季保护地蔬菜生产的重要环境因素之一。在低温条件下，植物细胞膜最先感知温度的变化，然后通过信号传递，产生一系列反应来抵御低温胁迫，例如：①增加细胞膜中不饱和脂肪酸的含量从而维持细胞膜的稳定性（Yadav，2010；Theocharis et al.，2012）；② 积累渗透调节物质可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸等来调节细胞的渗透势（王芳 等，2019）；③升高POD、SOD、CAT 等抗氧化酶活性，清除体内产生的活性氧（赵春梅 等，2014）。低温胁迫下，植物光合指标也会发生变化，主要表现为叶绿素含量的降低，净光合速率和最大PSⅡ光能转换效率（Fv/Fm）等指标的降低（Fu et al.，2016）。研究表明，耐低温性强的南瓜品种中渗透调节物质、抗氧化酶活性、叶绿素含量和光合速率均高于低温敏感品种（李凯，2008；梁雨昕等，2014；许小江 等，2015）。

目前，关于不同南瓜材料对于低温胁迫的响应已有报道，主要集中在不同种质生理指标的变化规律上，但相关研究还不够系统和深入，尚不能深入解析南瓜耐低温的生理机制。本试验以2 份耐低温材料和2 份低温敏感材料为试材，在人工气候室中进行昼/夜为10 ℃/2 ℃（12 h/12 h）的低温胁迫处理，以昼/夜为25 ℃/15 ℃（12 h/12 h）作为常温对照，测定不同材料在低温胁迫下相关渗透调节物质、叶绿素、光合作用参数和叶绿素荧光参数等指标，比较、分析各项指标间的差异及其相关性，以期为解析中国南瓜耐低温性机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试中国南瓜2 份耐低温种质（N1 和N2）和2 份低温敏感种质（N3 和N4）均为中国农业科学院蔬菜花卉研究所南瓜遗传育种课题组保存的自交6 代以上纯合自交系。N1 为柿饼南瓜，N2 为红皮架瓜，N3为C05，N4为西班牙南瓜。前期研究发现，这4 份种质在耐低温性方面存在显著差异。

1.2 试验方法

试验于2021 年10—11 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所人工气候室内进行。4 份材料分别播种于营养钵中，置于常温人工气候室中，昼/夜为25 ℃/15 ℃（12 h/12 h），每份材料播种80 粒。待幼苗第1 片真叶完全展开，第2 片真叶刚刚露头时，选取长势整齐一致的幼苗，分为2 组，每组30 株，一组进行低温胁迫处理，另一组作为常温对照。低温胁迫处理温度设置昼/夜为10 ℃/2 ℃（12 h/12 h），常温对照昼/夜为25 ℃/15 ℃（12 h/12 h），光照强度均为400 μmol·m·s。处理后第0、3、7、10 天对幼苗表型进行观察拍照，并分别取从上往下第2 片真叶测定相关生理指标；每处理3 次重复，每重复3 株。

可溶性糖含量测定：采用北京索莱宝科技有限公司植物可溶性糖含量检测试剂盒，使用蒽酮比色法测定，具体方法参照说明书。

可溶性蛋白含量测定：采用北京索莱宝科技有限公司植物Bradford 蛋白浓度测定试剂盒，使用考马斯亮蓝G-250 法测定，具体方法参照说明书。

叶绿素含量测定：采用乙醇浸提法测定叶片叶绿素含量（林宏辉，2012）。

光合气体交换参数测定：使用美国PP SYSTEMS CIRAS-3 便携式光合仪测定植物的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr），测定光强为800 μmol·m·s，CO浓度为400 μmol·mol，叶室温度为25 ℃，流速为500 μmol·s。选取从上往下第2片功能叶，之后每次测定相同的叶片，分别于第0、3、7 天测定，每次测定4 株。

叶绿素荧光参数测定：使用北京澳作生态仪器有限公司的OS5p 调制式叶绿素荧光仪进行测定，测定前将待测叶片进行暗适应20 min，避开叶脉，测定叶绿素的初始荧光（F）和最大荧光产量（Fm），计算光系统Ⅱ（PSⅡ）最大光化学效率（Fv/Fm）和PSⅡ潜在活性（Fv/F）。选取从上往下第2 片功能叶，之后每次测定相同的叶片，分别于第0、3、7 天测定，每次测定4 株。

1.3 数据处理

利用Excel 2010 软件进行数据整理，运用SPSS 软件进行生理生化指标分析，采用LSD 法进行差异显著性分析；利用SAS 9.0 软件对胁迫耐受系数进行相关性分析。

胁迫耐受系数=低温处理测定值/对照测定值

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对不同耐低温性中国南瓜幼苗表型的影响

低温胁迫后，不同的中国南瓜材料叶片表型之间差异明显（图1）。在经过低温胁迫处理3 d 后，叶片均出现了不同程度的干枯、卷曲；低温胁迫7 d 后，N3 和N4 受害较N1 和N2 严重，N3 叶片边缘失绿褪色，向内卷曲，N4 叶片大面积干枯，N1受害情况不明显，叶片有轻微失绿，N2 叶片边缘略有干枯，面积较小；低温胁迫10 d 后，N1 叶片出现黄化现象，N2 叶片与7 d 相比差异不大，叶片边缘干枯，N3 和N4 叶片受害严重，干枯程度加重。由此可以看出，低温敏感种质N3 和N4 的受害程度明显重于耐低温种质N1 和N2，在低温胁迫7 d后二者受害程度差异较为明显。

图1 低温胁迫后不同中国南瓜材料幼苗叶片表型变化

2.2 低温胁迫对不同耐低温性中国南瓜幼苗可溶性糖含量的影响

低温胁迫后，4 份中国南瓜材料的可溶性糖含量与同时期对照相比均升高，增长幅度不同材料间存在差异（表1），与常温对照相比N1、N2、N3和N4 在低温处理7 d 时可溶性糖含量分别上升到对照的8.41、8.74、5.78 倍和4.24 倍，耐低温种质可溶性糖含量的上升幅度明显大于低温敏感种质；处理10 d 时，耐低温种质N1 和N2 的可溶性糖含量仍明显高于低温敏感种质N3 和N4。

表1 低温胁迫对不同中国南瓜材料可溶性糖含量的影响 mg·g-1

2.3 低温胁迫对不同耐低温性中国南瓜幼苗可溶性蛋白含量的影响

从表2 可以看出，低温胁迫后，4 份中国南瓜材料的可溶性蛋白含量均呈先升高后降低再升高的变化趋势，但与同时期对照相比无明显规律。N4低温胁迫3 d 时，可溶性蛋白含量迅速升高，且与常温对照存在极显著差异；低温胁迫7 d 时，N1、N2 和N4 与同时期常温对照相比存在显著或极显著差异。不同种质在经过低温胁迫后可溶性蛋白含量变化差异较大，但耐低温种质与低温敏感种质间无明显差异。

表2 低温胁迫对不同中国南瓜材料可溶性蛋白含量的影响 mg·g-1

2.4 低温胁迫对不同耐低温性中国南瓜幼苗叶片叶绿素含量的影响

由表3 可知，4 份中国南瓜材料幼苗的叶片叶绿素含量总体上呈随着低温胁迫时间的延长而逐渐降低的变化趋势，最终均极显著低于同时期常温对照。低温胁迫3 d 时，4 份材料均与常温对照无显著差异；低温胁迫7 d 时N3、N4 与常温对照达极显著差异，而N1 和N2 则在低温胁迫10 d 时才与常温对照达到极显著差异水平。低温胁迫10 d 时，N1 的叶绿素含量最高；N2 在常温处理0、3 d 和7 d 时，与其他材料相比叶绿素含量均较低，低温胁迫后的降低幅度也较小。表明，耐低温种质能够在低温胁迫下更好地维持叶片叶绿素的含量。

表3 低温胁迫对不同中国南瓜材料叶片叶绿素含量的影响 mg·g-1

2.5 低温胁迫对不同耐低温性中国南瓜幼苗光合气体交换参数的影响

低温胁迫对不同耐低温性中国南瓜种质相对净光合速率的影响见表4，随着低温胁迫天数的增加，4 份材料的净光合速率均显著下降，胁迫时间越长，净光合速率越小；低温胁迫后，4 份材料与同时期常温对照均达极显著差异，说明低温胁迫严重影响中国南瓜幼苗的光合作用，导致净光合速率极显著降低。此外，经过低温胁迫后，耐低温种质的净光合速率在胁迫后同一处理时间均高于低温敏感种质，表明低温胁迫下低温敏感的中国南瓜幼苗光合能力受到的抑制更为严重。

表4 低温胁迫对不同中国南瓜材料光合气体交换参数的影响

气孔导度、胞间CO浓度和蒸腾速率作为重要的光合参数影响植物进行光合作用。由表4 可知，随着低温胁迫时间的延长，4 份材料幼苗叶片的气孔导度和蒸腾速率均明显下降，胞间CO浓度呈现先升高后降低的变化趋势。

2.6 低温胁迫对不同耐低温性中国南瓜幼苗叶绿素荧光参数的影响

Fv/Fm 表示植株PSⅡ的最大光化学效率，在逆境胁迫条件下变化明显；Fv/F表示PSⅡ的潜在活性，反映了植物潜在的最大光合能力（张守仁，1999）。由表5 可知，低温胁迫后，4 份中国南瓜材料的Fv/Fm 和Fv/F均出现了不同程度的下降，其中N3 下降幅度最大，N1 下降幅度最小。低温胁迫7 d 时，N3 和N1 的Fv/Fm 值分别下降到同时期常温对照的37.33%和60.00%，Fv/F分别下降到同时期常温对照的13.73%和30.84%，表明耐低温种质在经过低温胁迫后可保持较高的光能转化效率，抗寒性较强。

表5 低温胁迫对不同中国南瓜材料叶绿素荧光参数的影响

2.7 中国南瓜幼苗低温胁迫下生理指标之间的相关性

低温胁迫7 d 时，叶片表型受害明显，4 份中国南瓜材料的多个指标与同时期常温对照差异达显著水平，且叶绿素荧光参数未测定第10 天数据，故挑选低温胁迫后第7 天测定的生理生化指标进行胁迫耐受性指标的相关性分析。由表6 可知，胞间CO浓度与蒸腾速率呈极显著正相关，与Fv/F呈极显著负相关；Fv/F与蒸腾速率呈显著负相关，与Fv/Fm 呈显著正相关；Fv/Fm 与气孔导度呈显著负相关；净光合速率与叶绿素含量和可溶性糖含量分别呈显著正相关和极显著正相关；可溶性糖含量和叶绿素含量呈显著正相关。以上结果表明，蒸腾速率和胞间CO浓度与大部分指标呈负相关，起到负面作用，其值越高，种质的耐低温性越差；净光合速率、可溶性糖含量、叶绿素含量、Fv/F和Fv/Fm 等对种质的耐低温性起到正向作用，其值越高，耐低温性越强。

表6 中国南瓜幼苗低温胁迫耐受性指标的相关性分析结果

3 结论与讨论

渗透调节物质与植物的耐低温性密不可分。植物体内主要的渗透调节物质包括可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸等有机溶质以及Ca、K、Mg等无机离子。植株遭受低温胁迫时，通过主动积累渗透调节物质，提高细胞液的浓度来降低细胞内结冰的可能性，增强植株的抗寒性（颉建明等，2009）。研究表明，植物在受到低温胁迫后，耐低温性强的品种较冷敏感品种会积累更多的可溶性糖和可溶性蛋白（许娟 等，2016；王玉贤 等，2021）。可溶性糖，例如葡萄糖、果糖和蔗糖，在维持细胞结构和生物代谢过程中起着重要作用。一方面，作为渗透调节物质增加细胞膜的稳定性，并为植物提供营养；另一方面，作为代谢信号分子激活下游基因的表达（Lu et al.，2020）。本试验中，耐低温种质在低温胁迫后，可溶性糖含量的增加幅度明显高于低温敏感种质，表明增加渗透调节物质是提高中国南瓜种质耐低温性的重要途径。同时，随低温胁迫时间的延长，4 份材料的可溶性蛋白含量均呈现先增加后降低再增加的变化趋势，但不同耐低温性种质之间无明显差异，表明中国南瓜在低温胁迫后，合成的渗透调节物质种类可能存在多样性。经相关性分析，在低温胁迫7 d 时，可溶性糖含量与净光合速率和叶绿素含量呈极显著或显著正相关，表明可溶性糖含量的增加对稳定叶绿素含量及光合作用具有重要作用。因此，可溶性糖含量、叶绿素含量和净光合速率可以作为中国南瓜种质耐低温性鉴定的可靠指标。

低温胁迫下，植物被抑制的第一个代谢过程就是光合作用，光合器官的结构、光合作用相关的酶、光合电子传递以及碳同化过程都会受到影响（宋静爽 等，2019）。许多研究结果均表明，低温胁迫会导致植物叶绿素等光合色素含量的降低，净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO浓度等光合参数以及Fv/Fm 和Fv/F叶绿素荧光参数的下降（余叔文，1992；刘建 等，2009；徐晓昀 等，2016）。而低温胁迫后保持较高水平的光合作用有助于提高植物的耐寒性（Chen et al.，2015）。本试验结果与前人的研究结果基本一致（Farquhar &Sharkey，1982；周艳虹 等，2004；刘慧英 等，2007；郝平安 等，2018；段青青 等，2020；刘会芳 等，2020）。在本试验中，低温胁迫后，4 份中国南瓜材料的幼苗叶片叶绿素含量均呈下降趋势，叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）均随胁迫时间的延长逐渐降低，而胞间CO浓度（Ci）呈现先升高后降低的变化趋势，由此说明光合速率的下降主要是由非气孔因素引起的，较高的叶绿素含量是保持较高光合速率的重要因素。低温胁迫后，4 份材料的Fv/Fm 和Fv/F值均显著下降，耐低温种质的Fv/Fm 和Fv/F值均高于低温敏感种质，表明耐低温种质在低温胁迫后受到的伤害较轻，其PSⅡ仍能保持较大的光化学效率和较高的潜在活性。

低温胁迫会导致活性氧（ROS）的过量产生，因ROS 对细胞具有毒害作用，影响植物的生长发育（王芳 等，2019）。耐低温性强的植物，可以通过大幅增加抗氧化酶或抗氧化剂的含量或活性，提高清除细胞内自由基的效率，来避免或减轻低温对细胞的伤害（姚远 等，2010；赵春梅 等，2014；李凤梅 等，2019）。本试验中未进行抗氧化酶等生理指标的测定，N1 和N2 之所以耐低温性较强，是否与氧化还原途径相关，还有待于进一步深入研究。

低温胁迫下，耐低温性不同的4 份中国南瓜种质在生理响应方面存在显著的差异，耐低温性强的材料可以通过大幅提高细胞内渗透调节物质（可溶性糖），更好地维持叶片叶绿素含量，保持较高的光能转化效率，减轻对PSⅡ的伤害，进而维持较高的光合作用能力，来提高植株的耐寒性。