结球甘蓝一年两代繁殖技术及其在雄性不育转育中的应用

王冬梅 高晓旭 徐景秀 贾 俊

（1 北京华耐农业发展有限公司研究中心，北京 102200；2 北京市密云区农业技术推广站，北京 101500）

结球甘蓝（L.var.L.）简称甘蓝，是十字花科芸薹属甘蓝种中能形成叶球的一个变种，顶芽成球，生长周期短，产量高，质地脆嫩，营养丰富，耐贮运，在我国种植非常广泛。甘蓝为两年生草本植物，需经冬季2～3 个月的绿体低温春化才能开花结实，繁殖1 代至少需要1 年的时间，育种周期长，一个品种的育成一般需要10 年以上，对甘蓝种业发展极为不利。由于甘蓝的胞质不育转育简单，不育性容易保持，故此项技术在甘蓝雄性不育系的转育上得到广泛应用（季家磊 等，2016），育成了多个优良甘蓝品种（方智远 等，2003；庄木 等，2010；杨丽梅 等，2011）。纯合的高代自交系材料转育成雄性不育系又需6～8年的时间，致使甘蓝品种的育成时间几乎增加了一倍（Perez-Prat &van Lookeren Campagne，2002），时间过长，亟待寻找可以缩短育种时间的方法。前人对芸薹属植物通过春化阶段所需要的植株营养体大小、光照、温度以及感应低温的时间已有了较明确的研究结果（日本农山渔村文化协会，1985；许蕊仙，1986；张雪梅和许蕊仙，1989；余阳俊 等，2007），但是缺少综合考虑甘蓝世代繁殖所需要的条件，获得甘蓝世代繁殖所需最短时间的研究。本试验将甘蓝世代繁殖分为3 个主要阶段：绿体阶段（发芽到植株生长到合适大小）、春化到开花阶段（进入春化室到授粉）、成苗阶段（授粉到种子发芽）。探寻每个阶段所需要的最短时间，以期获得一种可以实现甘蓝一年繁殖两代的方法，缩短甘蓝的育种周期。由于整个繁殖世代的甘蓝植株均处于幼苗期，不能进行成株期的性状选择，因此利用SSR 引物在甘蓝幼苗期进行背景选择（刘基生 等，2014；于海龙，2015），获取遗传背景更接近保持系的不育系，作为下一个世代的回交母本。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在北京华耐农业发展有限公司研究中心昌平基地进行，参试甘蓝材料亦由该公司提供，4份高代自交系G158、G694、G639、G680；G158胞质不育的BC单株15 株，编号G158MS-1～G158MS-15；G639 胞质不育的BC单株9 株，编号G639MS-1～G639MS-9。其中G158 和G694 耐抽薹性弱，G639 耐抽薹性中等，G680 耐抽薹性强。

1.2 试验方法

以种子成苗为节点，一年分为两个周期：夏秋周期，6—11 月；冬春周期，12 月至翌年5 月。对可缩短生殖周期的2 个关键因素，即授粉到种子发芽时间、春化+开花时间进行筛选试验。

1.2.1 筛选适宜的胚珠剥取时间 为了缩短种子成熟所用的时间，在种荚中的种子成熟之前，剥取胚珠置于铺有灭菌滤纸（使用无菌水喷湿）的培养皿中，于培养箱中催芽，温度控制在25 ℃，光照16 h/黑暗8 h，喷洒无菌水保湿；待子叶展开，根系长度为1.5 cm 左右时，移栽到基质中。2020年5 月（冬春周期）选择4 份材料G158、G694、G639、G680，剥取胚珠时间分别为蕾期人工授粉后30、35、40、45、50 d；2020 年11 月中旬（夏秋周期）选择2 份材料G158、G639，剥取胚珠时间分别为蕾期人工授粉后45、50 d。不设重复，冬春周期每份材料剥取胚珠30～66 个，夏秋周期每份材料剥取胚珠100 个。调查记录发芽数、授粉至成苗天数、幼苗生长情况等，计算发芽率。

1.2.2 筛选适宜的植株大小和春化时间 夏秋周期，以耐抽薹性不同的G158、G639、G680 为试材，植株大小设置2 个水平：7～9 片真叶的小苗和13～15 片真叶的大苗。春化时间设置3 个梯度：50、60、70 d。不设重复，每处理10 株。2020 年7月中旬放入春化室，最低春化温度为7 ℃，红蓝光比例为3∶1 的LED 灯24 h 光照；春化完成后定植于温室，前期为了降温，防止脱春化，温室温度白天控制在25 ℃左右，夜间15 ℃左右，并利用日光灯补充光照；10 月中下旬授粉结籽后，为了保温，在温室中搭建拱棚并覆盖保温被。

冬春周期，以G158、G639 为试材，植株大小为7～9 片真叶的小苗，春化时间设置5 个梯度：50、55、60、65、70 d；不设重复，每处理10 株。2021 年1 月中旬放入春化室，最低春化温度为4℃，红蓝光比例为3∶1 的LED 灯24 h 光照；春化完成后定植于大棚，正常水肥管理。

调查记录抽薹开花株数、抽薹开花天数、植株生长情况等，计算抽薹开花率、春化+开花天数。

1.2.3 利用SSR 标记选择回交后代 参试材料 为G158 胞质不育的BC单株G158MS-1～G158MS-15，以G158 的相应保持系作为对照；G639 胞质不育的BC单 株G639MS-1～G639MS-9，以G639 的相应保持系作为对照。分别取植株的幼嫩叶片，采用改良CTAB 法（Yan et al.，2008）提取DNA，-20 ℃保存。

选用均匀分布在甘蓝9 条染色体上的扩增稳定、条带清晰、扩增差异明显、多态性好的27 对EST-SSR 引物，包括NT/Y 2473—2013《结球甘蓝品种鉴定技术规程SSR 分子标记法》公布的20对甘蓝核心引物，刘基生等（2014）公布的7 对EST-SSR 引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反应体系10 μL，包含DNA模 板4 μL，10× PCR Buffer（含MgCl）1 μL，10 μmol·L上、下游引物各0.4 μL，dNTP（10 μmol·L）0.2 μL，DNA 聚合酶0.1 μL，ddHO 3.9 μL。PCR 反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，32 个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR 产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，快速银染法染色后拍照。

确定每对引物在24 个不育系单株和2 个保持系中扩增的等位变异数，统计每份样品等位变异的有无，有记为“1”，无记为“0”，建立数据库。利用NTSYSPC 2.10e 软件，计算保持系与不育系之间的亲缘关系，采用非加权平均法（UPGMA）进行聚类分析，构建聚类树。

2 结果与分析

2.1 不同胚珠剥取时间对甘蓝成苗的影响

2.1.1 冬春周期 从表1 可以看出，随着授粉至剥取胚珠天数的增加，4 份甘蓝材料的发芽率均呈增加趋势；但不同材料的胚珠适宜剥取时间有一定差异，G158 授粉后40 d 的胚珠发芽率达到72.73%，G694 授粉后45 d 的胚珠发芽率为70.00%，而G639 和G680 授粉后50 d 的胚珠发芽率才超过60%。授粉后30～35 d 的胚珠软嫩，幼胚很小，未发育完全，基本不出芽，胚珠很快就褐化死亡，极个别成苗也发育畸形；授粉后45～50 d 的胚珠成苗大部分正常，授粉至成苗时间为50～57 d。表明，冬春周期剥取胚珠的最佳时间为授粉后45～50 d。

表1 冬春周期不同胚珠剥取时间对甘蓝发芽率及成苗情况的影响

2.1.2 夏秋周期 此周期种子成熟时温度较低，胚珠发育需要较长时间，G639 授粉后45 d 的胚珠发芽率较低，幼苗长势慢，部分畸形；G158 授粉后45 d 的胚珠发芽率虽然达到60.00%，但也明显低于冬春周期，幼苗长势慢（表2）。表明，夏秋周期剥取胚珠的最佳时间为授粉后50 d，幼苗发育正常，授粉至成苗时间为56～58 d。

表2 夏秋周期不同胚珠剥取时间对甘蓝发芽率及成苗情况的影响

2.2 不同植株大小和春化时间对甘蓝开花的影响

2.2.1 春化植株大小 从表3 可以看出，春化时间为50 d 时，由于春化时间较短，G158 两种大小的幼苗都表现为春化不完全，前期死蕾，抽薹开花时间长；而G639、G680 未通过春化。春化时间为60 d 时，G158 两种大小的幼苗都通过了春化，且抽薹开花天数相近；G639 大苗开花情况较小苗好，但是都可以正常授粉得到种子，抽薹开花天数接近；G680 基本未通过春化。春化时间为70 d 时，G158和G639 两种大小的幼苗都通过了春化，抽薹开花时间较春化60 d 处理缩短了4～6 d；而G680 两种大小的幼苗都表现为春化不完全。总体上讲，营养体较大的植株并未明显缩短春化时间，并且所需抽薹开花天数也与小苗接近，而7～9 片真叶小苗营养体生长需要40 d 左右，13～15 片真叶大苗营养体生长需要50 d 左右，所以在以缩短生殖周期为目标的宗旨下，宜选择7～9 片真叶的小苗进行春化。

2.2.2 夏秋周期的春化时间 从表3 还可以看出，3 种不同耐抽薹类型的甘蓝材料存在一个共同的特点：春化的天数越短，抽薹开花所需要的天数越长，而春化+开花的总天数相差不大，但是春化时间短，正常抽薹开花率低，所以在保证正常抽薹开花总时间最短的情况下，应选择春化时间较长的组合。G158 小苗的最佳春化时间为60 d，春化+开花天数为90 d；G639 小苗的最佳春化时间亦为60 d，虽然抽薹枝条少，但可以正常授粉结籽，春化 +开花天数为92 d；而G680 由于冬性强，春化时间50、60 d 处理的小苗均未通过春化，春化60 d 处理的大苗仅1 株顶端开了几朵花，春化时间延长到70 d 时，小苗30%抽薹，但开花少，死蕾严重，大苗80%抽薹，但是枝条少，死蕾严重，所以后期试验中剔除了G680。

表3 夏秋周期不同植株大小与春化时间对甘蓝开花的影响

2.2.3 冬春周期的春化时间 本周期甘蓝材料的开花时间集中在春季的4 月，相同的春化时间条件下抽薹开花时间较秋季短，所以春化+开花的总时长较秋季短，G158 最佳春化时间为55 d，抽薹开花率达到80%，春化+开花天数为80 d；G639 最佳春化时间为60 d，抽薹开花率70%，可以正常开花授粉，春化+开花天数为85 d（表4）。

表4 冬春周期不同春化时间对甘蓝开花的影响

2.3 甘蓝一年繁殖两代所需时长

由于秋季在绿体阶段进行了加温和补光处理，所以两个周期中绿体生长所需时间无明显差别。统计不同甘蓝材料一年繁殖两代需要的时长可知（表5），G158 夏秋周期完成世代需要186 d，冬春周期需要170 d，总计356 d，可以实现一年繁殖两代；G639 夏秋周期完成世代需要190 d，冬春周期需要181 d，总计371 d，略长于1 年的时间，原因是G639 所需的春化时间和种子成熟时间都比较长。

表5 不同甘蓝材料不同周期繁殖所需时间

2.4 利用SSR 标记选择回交后代

27 对SSR 多态性引物在24 个不育系单株和2个保持系中共扩增得到63 个等位变异，每对引物产生2～5 个。27 对引物的多态性信息含量变化范围为0.23～0.57，具有较好的鉴别能力，图1 为部分引物的PCR 扩增结果。

图1 部分引物对甘蓝不育系的PCR 扩增结果

由图2 可知，26 份材料被明显分为两个类群，类群Ⅰ中，G158MS-3 和G158MS-8 与G158 相应保持系的亲缘关系最近；类群Ⅱ中，G639MS-6 和G639MS-7 与G639 相应保持系的亲缘关系较近。所以，下一世代中可采用G158MS-3、G158MS-8 和G639MS-6、G639MS-7作为各自保持系的回交母本。

图2 甘蓝不育系与回交父本的聚类结果

3 讨论与结论

甘蓝通过春化的最适温度为0～4 ℃，通过春化的时间因品种耐抽薹性不同而差异较大，一般为40～90 d，幼苗越大通过春化的时间越短（李文平，2010；王凤娇 等，2012）。本试验中进行春化的温度是4～7 ℃，并采用红蓝光比例为3∶1 的LED灯24 h 补光，除冬性强的甘蓝材料外，基本都能在60 d 之内通过春化；春化时间对甘蓝抽薹开花的影响要大于幼苗大小的影响，可能是因为在春化过程中进行了补光处理，幼苗处于持续生长的状态，部分抵消了幼苗大小的影响程度。

为了缩短种子成熟所需要的时间，本试验借鉴了胚挽救的方法。前人研究多将胚挽救应用于远缘杂交获得种间杂交种中（Zhang et al.，2004；Wen et al.，2008，于海龙，2015）；并且在远缘杂交中，为了赶在胚珠败育之前进行胚挽救，通常剥取胚珠的时间都比较早，一般在授粉后10～15 d，10 d 后有胚萌发，但成活率非常低（于海龙，2015；姜娇，2018）。此类试验中的胚挽救从萌发到成苗需要经过愈伤阶段，而从剥取胚珠到成苗所需要的时间未见报道。本试验所用材料非远缘杂交，胚珠在子房中不会败育，为了提高胚珠的成活率，延长了取胚的时间，结果发现授粉后35 d 之前剥取的胚珠成活率很低，绝大部分败育死亡，结合胚珠发芽率和缩短成苗时间两项因素，最终确定合适的胚珠剥取时间为授粉后45～50 d。

应用本试验方法，冬性不是很强的甘蓝材料基本上可以实现1 年繁殖2 代，但是对于冬性强的甘蓝材料还需要进一步探索可以缩短时间的步骤，比如采用更低的春化温度、使用生长激素等来缩短春化时间，采用增加光照强度、延长光照时间等来缩短抽薹开花时间，采用更好的办法缩短种子成熟所需的时间等。由于整个试验过程中甘蓝植株均处于幼苗期，不能进行成株期的性状选择，所以本试验方法仅适用于甘蓝雄性不育转育，利用SSR 标记选择时有明确的选择方向，并不适用于一般材料的分离纯化。如果有条件，可以通过增加标记甚至采取测序的方法对幼苗进行筛选，对某些需要加快纯化的材料进行幼苗期的选择，获得所需要的特定材料。