超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用法测定14种蔬菜中灭蝇胺的残留

俞所银，闫晴，梁佳

1(上海市质量技术监督检验技术研究院，上海，200233)2(浙江海洋大学 食品与药学学院，浙江 舟山，316022) 3(浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室，浙江 舟山，316021)

灭蝇胺(cyromazine)是一种用于防治多种叶菜类蔬菜、茄果类、豆类的美州斑潜蝇、豆杆黑潜蝇、葱斑潜叶蝇等的低毒杀虫剂。其对人体皮肤和眼睛具有刺激作用[1]；对动物胎儿可造成骨骼发育迟缓、存活率下降等问题[2]；在农作物生长过程中和动物体内都会降解代谢成三聚氰胺，经胃酸作用转化为三聚氰酸，三聚氰酸与未转化的三聚氰胺形成结晶，会导致公鼠膀胱肿瘤[3-6]。因此，国际组织和许多国家都已经制定了相应最大残留限量标准。GB/T 2763—2019《安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定了灭蝇胺在黄瓜、豇豆、菜豆、食荚豌豆、扁豆、蚕豆、豌豆中最大残留量分别为1、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5 mg/kg，但对韭菜、青菜、茄子、菠菜、包菜、鸡毛菜、青椒、红椒、番茄、大白菜、小青菜、芹菜等尚未明确规定。

现行有效的NY/T 1725—2009 《蔬菜中灭蝇胺残留量的测定》检测行业标准规定了黄瓜、番茄、菜豆、甘蓝、大白菜、芹菜、萝卜等蔬菜中检出限0.02 mg/kg。但日常检测发现受基质影响(韭菜样最为明显)，在灭蝇胺出峰时间处有干扰峰，分离度差，且优化梯度后会有其他蔬菜基质干扰，加标样分析也往往因基质效应而掩盖，对非法添加微过量的样品造成误判，对蔬菜类质量安全监管带来困难，对百姓饮食安全和身体健康也造成了潜在的风险。相关文献报道过高效液相色谱法[7]、液相色谱-质谱法[8-11]、量子点荧光探针法[12]和超高效液相色谱-质谱联用同位素内标法[13]对灭蝇胺残留的检测，此类方法存在适用基质单一、基质影响严重、操作繁琐、保留时间过短和回收率低的不足。

故本文采用“乙腈提取/氮吹”前处理方法、基质曲线和超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用法(ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry, UPLC-QQQMS)测定了韭菜、豇豆、黄瓜、青菜、茄子、菠菜、包菜、鸡毛菜、青椒、红椒、番茄、大白菜、小青菜、芹菜共14种日常送检灭蝇胺残留的新鲜蔬菜。改善了灭蝇胺在C18色谱柱上出峰早、基质效应影响判断、方法适用范围窄、操作繁琐的问题，旨在为灭蝇胺在新鲜蔬菜上的风险评估、批量快速检测上提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

韭菜、豇豆、黄瓜、青菜、茄子、菠菜、包菜、鸡毛菜、青椒、红椒、番茄、大白菜、小青菜、芹菜共14种新鲜蔬菜样品均为日常抽检样品。

乙腈(色谱纯)，美国Fisher公司；甲酸(色谱纯)，美国ACS化学试剂；乙酸铵、氯化钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。灭蝇胺标准品(纯度≥99.9 %，100 μg/mL)，天津阿尔塔有限公司。

6500 Q-TRAP 三重四级杆串联质谱仪，美国AB公司；Agilent 1290 超高压液相色谱仪，美国Agilent公司；5804 高速离心机，德国Eppendorf公司；SK8210LHC 型超声波清洗仪，上海科导超声仪器有限公司；G560E 涡旋振荡器，美国Scientific Industries；Milli Q 超纯水器，美国Millipore公司；KD 200 氮气吹扫仪，杭州奥盛公司；0.22 μm Filter Unit滤膜，天津博纳艾杰尔科技有限公司；分析天平(感量0.1 mg)，上海梅特勒-托利多仪器公司。

1.2 标准溶液配制和标准曲线

准确移取灭蝇胺标准品，用乙腈溶解配制成质量浓度为1 μg/mL的标准储备液。用乙腈逐级稀释标准液，得到0.000 5、0.001、0.002、0.004、0.005、0.001 0、0.020、0.050和0.100 μg/mL的一系列纯溶剂标准工作溶液。

1.3 样品处理方法

按GB/T 8855抽取的新鲜蔬菜样品取可食部分切碎、混匀、密封、作为试样，表明标记，置于0～4 ℃冷藏保存待检。另一部分-20 ℃冰箱保存备样。

分别称取10 g(精确至0.000 1 g)样品于50 mL具塞玻璃管中，加入20 mL乙腈，涡旋1 min后超声提取20 min；加5 g NaCl涡旋1 min后9 500 r/min离心2 min，取5 mL上清液40 ℃氮吹干，加入1 mL乙腈溶解，0.22 μm Filter Unit滤膜过滤，UPLC-QQQMS分析。

(1)乙腈提取：分别称取10 g(精确至0.000 1 g)样品于50 mL具塞玻璃管中，加入1 μg/mL、0.4 mL灭蝇胺标准储备液(即40 ng/g)，加入20 mL乙腈，涡旋1 min后超声提取20 min；加5 g NaCl涡旋1 min后9 500 r/min离心2 min，上清液0.22 μm Filter Unit滤膜过滤，UPLC-QQQMS分析。

(2)乙腈提取/氮吹：分别称取10 g(精确至0.000 1 g)样品于50 mL具塞玻璃管中，加入1 μg/mL、0.4 mL灭蝇胺标准储备液(即40 ng/g)，加入20 mL乙腈，涡旋1 min后超声提取20 min；加5 g NaCl涡旋1 min后9 500 r/min离心2 min，取5 mL 上清液40 ℃氮吹干，加入1 mL乙腈溶解，0.22 μm Filter Unit滤膜过滤，UPLC-QQQMS分析。

(3)QuEChERs盐包：分别称取10 g(精确至0.000 1 g)样品于50 mL具塞玻璃管中，加入1 μg/mL、0.4 mL灭蝇胺标准储备液(即40 ng/g)，加入20 mL乙腈，涡旋1 min后超声提取20 min；加入QuEChERs盐包[无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合包(质量比4∶1，7.5 g)]，涡旋1 min后9 500 r/min离心2 min，取5 mL上清液40 ℃氮吹干，加入1 mL乙腈溶解，0.22 μm Filter Unit滤膜过滤，UPLC-QQQMS分析。

(4)QuEChERs法：分别称取10 g(精确至0.000 1 g)样品于50 mL具塞玻璃管中，加入1 μg/mL、0.4 mL灭蝇胺标准储备液(即40 ng/g)，加入20 mL乙腈，涡旋1 min后超声提取20 min；加入QuEChERs盐包[无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合包(质量比4∶1，7.5 g)]，涡旋1 min后9 500 r/min离心2 min，取上清液10 mL于固相萃取净化管(无水硫酸镁900 mg，N-丙基乙二胺300 mg，十八烷基硅烷键合硅胶300 mg，硅胶300 mg，石墨化碳黑90 mg)中，涡旋使充分混匀，3 000 r/min离心2 min，取上清液5 mL上清液40 ℃氮吹干，加入1 mL乙腈溶解，0.22 μm Filter Unit滤膜过滤，UPLC-QQQMS分析。

(5)SCX固相萃取柱：分别称取10 g(精确至0.000 1 g)样品于50 mL具塞玻璃管中，加入1 μg/mL、0.4 mL灭蝇胺标准储备液(即40 ng/g)，加入20 mL乙腈，涡旋1 min后超声提取20 min；加5 g NaCl涡旋1 min后9 500 r/min离心2 min，取5 mL上清液40 ℃氮吹干，加入0.1 mol/L盐酸溶液定容至2 mL；转入SCX强阳离子交换萃取柱中(甲醇、水各5 mL预淋活化)，2 mL 0.1 mol/L盐酸溶液润洗残渣转入SCX柱。依次水、甲醇5 mL淋洗，弃液抽干小柱，用7.5 mL氨水-甲醇(体积比5∶95)洗脱，收集洗脱液，40 ℃氮吹干，加入1 mL乙腈溶解，0.22 μm Filter Unit滤膜过滤，UPLC-QQQMS分析。

(6)CARB/SCX/PSA固相萃取柱：前处理步骤同(5)。

(7)MCX固相萃取柱：前处理步骤同(5)。

1.4 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1 mm×150 mm×1.7 μm)；流动相：A相：含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液，B相：乙腈；等度洗脱：0～5 min，80%A；柱温为35 ℃，流速0.25 mL/min，进样体积为0.5 μL。

1.5 质谱条件

采用电喷雾离子源正离子模式(electron spray ionization, ESI+)；多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)模式；雾化气压力0.276 MPa；辅助加热器压力0.138 MPa；气帘气压力0.172 MPa；电喷雾电压4 000 V；离子源温度350 ℃。以离子对(母离子和2个子离子)的信息比较进行定性分析，以响应值最高的子离子为定量离子，灭蝇胺在MRM模式下质谱采集参数见表1。

表1 灭蝇胺质谱参数Table 1 Chromatogram parameters of cyromazine

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

将质量浓度为0.1 μg/mL的灭蝇胺标准液，不接液相色谱，使用手动针泵进样方式直接连接质谱，根据灭蝇胺结构选择ESI+下全扫描，确定目标物的分子离子，然后将分子离子作为母离子，在一定的碰撞能量和碰撞气体，再次全扫描二级离子选取丰度相对较大、干扰相对较小的2个子离子分别作为定量、定性离子，并优化去簇电压、碰撞能量值，质谱参数见表1，质谱图见图1。

a-定量离子MYA1；b-定量离子MYA2图1 灭蝇胺标准品色谱图Fig.1 The chromatogram of cyromazine注：MYA1、MYA2均为0.1 μg/mL，乙腈配制

2.2 色谱条件优化

2.2.1 色谱柱的选择

根据灭蝇胺结构：三聚氰胺与1个三元碳环相连，正负电荷中心不重合，偶极矩非0，属于极性较大的化合物，因此在反相色谱柱上很难被保留。使用C18反相色谱柱分析发现保留时间为1.0 min左右，几乎没什么保留，可以加入离子对试剂解决，但离子对试剂难以去除且容易污染色谱柱。正相色谱柱对极性化合物有较好的保留，能得到对称的峰形，但正相色谱采用非极性流动相(如正己烷)，不利于离子化，响应低不易被检测，而GB/T 20769—2008中450种农药绝大数是极性或弱极性的化合物。因此，本实验比较了Agilent SB-C18(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)、UPLC-T3(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)、ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1 mm×150 mm×1.7 μm)、氨基柱对灭蝇胺的分析。在酸性或高比例水相的流动相下(≥40%)氨基柱寿命短、因此氨基柱不适用。结果发现，在相同的质谱条件下，C18、T3柱上的灭蝇胺在0.80～0.90 min较早出峰，与有机溶剂峰或杂质峰易重合；HILIC色谱柱上灭蝇胺保留时间为2.00 min，分析时间短、峰形对称良好，见图1。因此确定了ACQUITY UPLC BEH HILIC作为分离色谱柱。

2.2.2 流动相的选择

考察乙腈-甲酸水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸/乙酸铵、甲醇-甲酸/乙酸铵溶液作为流动相对灭蝇胺的色谱峰和响应值的影响。结果发现，甲酸/乙酸铵比甲酸水的响应高出1.5倍，乙腈-甲酸/乙酸铵质谱响应和峰型上优于甲醇-甲酸/乙酸铵，因而选择“乙腈-甲酸/乙酸铵”为流动相溶。进一步考察乙酸铵浓度差异，比较了含0.1%甲酸的水溶液、含0.1%甲酸的5、10、20 mmol/L乙酸铵溶液。结果发现，5、10、20 mmol/L乙酸铵溶液下灭蝇胺保留时间均在2.38 min，见图2，选择5 mmol/L低溶度的乙酸铵溶液有利于延长色谱柱、仪器使用寿命。而含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液获得更好的峰形，这主要是在ESI+模式下电离时提供更多的H+，使离子化效率提高，从而提高分离效果和改善峰形。

a-定量离子MYA1；b-定性离子MYA2图2 韭菜基质中加标灭蝇胺的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of cyromazine spiked in garlic chives matrix注：MYA1、MYA2均为2.0 μg/mL，韭菜基质加标样

2.2.3 洗脱梯度的选择

鉴于主要是对蔬菜中灭蝇胺残留的定量分析，因此将先前优化的8 min/单针的梯度洗脱：0.25 mL/min，0～1 min、20%A，1～3 min、20%A～80%A，3～5 min、80%A，5～5.1 min、80%A～20%A，5.1～8 min、20%A；改为6 min/单针的等度洗脱：0～5 min、80%A，缩短了分析时间且得到了较好的保留。

2.3 样品前处理方法的选择和优化

对比已报道文献中对使用过的固相萃取净化发现，石墨碳黑粉、石墨/NH2串接柱均会吸附灭蝇胺，导致回收率下降；C18、NH2固相萃取柱色素、杂质吸附效果一般，进样分析发现在目标物峰附近有杂质干扰；MCX固相萃取柱效果相对较好，回收率在65.4%～108.8%均有报道[12-13]。因此本文选择干扰较强的韭菜为基质，加标样进行比较：(1)乙腈提取、(2)乙腈/氮吹、(3)QuEChERs盐包、(4)QuEChERs法、(5)SCX、(6)CARB/SCX/PSA和(7)MCX 固相萃取柱法，结果发现，QuEChERs盐包因与干扰峰无法完全分离，导致平均加标回收率偏高；“乙腈提取/氮吹”、“MCX固相萃取柱法”平均加标回收率接近值，但“乙腈提取/氮吹”法的前处理操作更便捷；“乙腈提取/氮吹”法因浓缩后样品的化合物响应强度远远大于目标物附近的杂质响应，目标物定量更准确，并且因浓缩后样品的pH变化引起化合物峰面积更大且峰型对称，结合检测效率与成本，选择“乙腈提取/氮吹”法为最佳前处理方法，数据见表2。

表2 不同前处理法韭菜中灭蝇胺的回收率(n=3)Table 2 Recoveries of cyromazine in garlic chives by different pretreatment methods (n=3)

2.4 方法学验证

2.4.1 基质效应影响

选取14种阴性新鲜蔬菜作为空白样品，按照“1.3”方法前处理，得到14种空白基质提取液。用乙腈逐级稀释，得到0.000 5、0.001、0.002、0.005、0.020、0.050、0.100 μg/mL的一系列基质标准工作溶液。按“2.1”～“2.3”优化好的条件分析。外标法绘制基质标准曲线[其中，待测物质量浓度为横坐标(X，mg/L)，对应定量离子对的峰面积为纵坐标(Y)]。样品的基质效应(matrix effect，ME)=基质标准曲线斜率/溶剂绘制的标准曲线斜率，当ME值越接近1时，表明样品的基质效应越小[14];ME<1，基质抑制作用；ME>1基质增强作用。如表3所示，14种新鲜蔬菜基质均对灭蝇胺有明显的抑制效应，且不同基质间存在明显的区别，与郝国辉等[8]、徐炜枫[14]的研究结果一致。为了减小样品的基质效应，提高方法分析的准确度，本文以空白样品提取液配制的基质标准工作曲线，外标法定量进行试验。

2.4.2 方法的线性范围、检出限和定量限

准确吸取质量浓度为1 μg/mL的灭蝇胺标准液，用14种空白基质溶液稀释成0.000 5、0.001、0.002、0.005、0.020、0.050、0.100 μg/mL的一系列基质标准工作溶液；按本试验优化的条件分析，以定量离子峰面积为纵坐标，灭蝇胺含量(μg/kg)进行线性回归。结果表明，14种新鲜蔬菜中灭蝇胺在0.000 5～0.100 μg/mL内具有良好的线性关系，以信噪比S/N=3、S/N=10分别计算出检出限、定量限，见表3。

表3 14种新鲜蔬菜中灭蝇胺的基质效应和线性方程、检出限和定量限Table 3 Matrix effects, linear equations, limits of detection and limits of quantification of cyromazine in 14 kinds of fresh vegetables

2.4.3 方法的准确度和精密度

称取14种(n=3)对应阴性蔬菜样品，按GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》[15]的方法技术要求，分别添加2.0、4.0、20.0 μg/kg(定量限的1倍、2倍和10倍)[16]，按“1.3”方法前处理，连续测定6次，结果表明,方法的回收率80%～113%，精密度0.56%～7.21%，见表4。

2.5 实际样品测定

采用已建立的方法对上海市、扬州市、苏州市姑苏区抽查新鲜蔬菜60份进行灭蝇胺检测，其中38份样品被检测出，残留量为0.8～40 μg/kg，其余均未被检出；而对比现行有效NY/T 1725—2009《蔬菜中灭蝇胺残留量的测定》标准,样品中均未检出灭蝇胺，且基质曲线回归方程也无法测出，这主要由仪器灵敏度差异决定。6500 Q-TRAP ESI+扫描、MRM模式下1pg利血平，信噪比≥160 000∶1，50 fg和1 pg 利血平分别连续进样10次，峰面积变异系数<2%，灵敏度高于液相色谱法数量级以上，因此优点样品前处理更简便、抗干扰强，实验表明UPLC-QQQMS在测定蔬菜中灭蝇胺低含量残留方法方面具有明显优势。

表4 14种新鲜蔬菜中灭蝇胺残留量的回收率 和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of cyromazine in 14 kinds of fresh vegetables(n=6)

3 结论

本试验通过“乙腈提取/氮吹”前处理方法、基质曲线结合UPLC-QQQMS测定了韭菜、豇豆、黄瓜、青菜、茄子、菠菜、包菜、鸡毛菜、青椒、红椒、番茄、大白菜、小青菜、芹菜共14种日常送检灭蝇胺残留的新鲜蔬菜。该方法前处理简单、操作便捷、检测快速，方法重现性好、准确度高且精密度好，同时解决了现行NY/T 1725—2009 《蔬菜中灭蝇胺残留量的测定》行业标准中基质影响造成HPLC分析方法的缺陷；为灭蝇胺在蔬菜上的风险评估、批量快速检测提供参考。