两种蛋清蛋白-壳聚糖乳液负载β-胡萝卜素的性能对比研究

高博，潘晴楣，张志鹏，胥伟*

1(沈阳中街冰点城食品有限公司，辽宁 沈阳，110164)2(武汉轻工大学 食品科学与工程学院，湖北 武汉，430023)

单层乳液的油滴仅被单独一层乳化剂覆盖，蛋清蛋白-壳聚糖混合乳液是以蛋清蛋白-壳聚糖复合粒子作为乳化剂制备而成的单层乳液。单层乳液的固体颗粒真实吸附后将在界面上稳定存在，并且可以增加连续相黏度，从而减缓乳液的分层速率，降低乳析指数[1]。由于单层乳液在某些条件下稳定性较差，为了提升乳液的稳定性，可以采用化学改性、低能乳化、微乳液聚合、逐层静电沉积技术等方法制备多层乳液[2]。双层乳液是一种具有2层界面的乳液，一般通过层-层静电自组装技术形成，其2个界面层可由蛋白质、多糖等生物聚合物或磷脂等小分子表面活性剂以静电吸附或共价结合的方式形成于乳液液滴的表面。作为一种传递体系，与传统的单层乳液相比，双层乳液在结构稳定性和抵抗环境压力(如酸碱度、温度和离子强度等)方面更具优势，能对所包裹的生物活性物质提供更好的保护，且具有一定的控释能力[3]。

蛋清蛋白中包含了大量的疏水氨基酸，使得蛋清蛋白具有良好的两亲性质，是制备Pickering颗粒的理想原料[4]。研究表明，超声处理的蛋清蛋白凝胶颗粒是制备Pickering乳液的理想材料[5]。壳聚糖来自于几丁质的碱性脱乙酰化，是一种潜在的pH响应性聚合物。pH小于6.5时，氨基的质子化使其溶解，反之则不溶解[6]。壳聚糖的不溶性有利于形成不溶性壳聚糖颗粒，从而有利于Pickering的乳化性能。壳聚糖颗粒可以吸附在油水界面，即使在低浓度下也可以稳定Pickering油/水乳液。蛋白质和多糖已被证实可以用来稳定Pickering乳剂，它们的复合粒子如蛋白质-蛋白复合粒子、多糖-多糖复合粒子和多糖蛋白复合粒子理论上都可以作为Pickering乳剂的稳定剂。WANG等[7]通过壳聚糖和明胶之间的静电相互作用制备了蛋白质-多糖复合物颗粒。此外，不同颗粒的结合可以相互补充，提高在Pickering乳液中的性能。蛋白质-多糖复合物颗粒兼具2种生物聚合物的良好特性及其协同效应[8]，蛋白质和多糖具有不同的固有特性，它们的组合可以改善其特性，并赋予水包油Pickering乳液更好的动力学稳定性[9]。与纯蛋白质或多糖颗粒相比，蛋白质多糖复合物颗粒具有更强的乳化性能，可作为Pickering稳定剂，这归因于复合颗粒稳定的Pickering乳液具有较厚的界面层[10]。

β-胡萝卜素是一种抗氧化剂，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养素，在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上有显著的作用，并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病[11]。但是，由于其极低的水溶性，化学和代谢不稳定性以及体内生物活性差，β-胡萝卜素在食品中的应用，尤其是营养保健品强化食品的应用受到阻碍[12]。针对β-胡萝卜素稳定性差、易降解及水不溶性的问题，乳液致密的界面层可以防止不稳定的生物活性物质降解，乳液递送系统是提高β-胡萝卜素稳定性以及拓宽其应用的有效途径。由于蛋白质-多糖复合粒子稳定的混合乳液与双层乳液均具有较好的乳液性能，因此本文制备了以蛋清蛋白-壳聚糖复合粒子为稳定剂的混合乳液和蛋清蛋白-壳聚糖双层乳液，对比了这2种乳液在负载β-胡萝卜素后热稳定性、抗消化稳定性及贮藏稳定性的变化，以期为构建一种功能活性物质递送载体提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋，神丹蛋品有限公司；大豆油，益海嘉里食品营销有限公司；盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、考马斯亮蓝试剂盒、壳聚糖、β-胡萝卜素、黏蛋白、胃蛋白酶、胰酶、脂肪酶，上海叶源生物有限公司；谷氨酰胺转胺酶(100 U/g)，江苏一鸣生物股份有限公司。

1.2 仪器与设备

YB-1000A 型纳米粒度、Zeta电位和分子质量分析仪，英国MALVERN公司；超声细胞粉碎机、冷冻干燥机、XHF-DY型高速分散器，宁波新芝生物科技股份有限公司；UV2000紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 负载β-胡萝卜素的蛋清蛋白-壳聚糖乳液的制备

参考GUO等[13]的方法并稍作改动，分离出新鲜鸡蛋的蛋清，在室温下中速搅拌1 h后，过滤除去不溶性物质，测得蛋清蛋白的含量为10%(质量分数)。取30 mL的蛋清蛋白溶液在一定功率下超声10 min，用1 mol/L HCl溶液调整蛋清的pH至7.0，利用磁力搅拌器在室温下搅拌2 h后加入1%(质量分数)的TG酶水浴反应2 h，将蛋清蛋白溶液置于90 ℃水浴加热40 min，然后立即冰浴冷却。在4 ℃条件下静置24 h后形成凝胶，将凝胶捣碎，并用去离子水稀释样品。预均质2 min，转速为10 000 r/min。再利用高压微射流均质机在20 000 psi下均质3次，得到蛋清蛋白凝胶颗粒。

混合乳液的制备：将质量分数为4%的蛋清蛋白凝胶颗粒分散液与质量分数0.6%的壳聚糖溶液在pH为6的条件下以2∶1的质量比混合形成液滴，再加入体积分数为40%的负载β-胡萝卜素的大豆油。为了使油滴均匀分散于界面，将混合液体置于高速均质机下以15 000 r/min的转速分散2 min，即制得混合乳液。

双层乳液的制备：采用层层组装静电沉积技术，在蛋清蛋白Pickering乳液上吸附连续沉积多层聚电解质，即可形成多层乳液。本研究采用饱和法，即在没有中间漂洗步骤的情况下，通过从溶液中吸附聚电解质来构建层。参考SILVA等[14]的方法并稍作修改，取质量分数为4%蛋清蛋白凝胶颗粒分散液，体积分数为40%的大豆油，调整体系的pH值为6，再加入体积分数为40%的负载β-胡萝卜素的大豆油，将混合液体置于高速均质机下以15 000 r/min的转速分散2 min，制得蛋清蛋白Pickering乳液。然后向体系中加入体积分数为0.6%的壳聚糖溶液，通过从溶液中吸附聚电解质构建层，以15 000 r/min的转速分散2 min，即制得双层乳液。

1.3.2 粒径的测定

取新鲜制备的乳液，将其稀释100倍后使用Mastersizer 3000粒度分布仪对其进行粒径分布分析。其参数为：颗粒吸收率为0.001，颗粒折射率为1.450，分散剂折射率为1.330，密度为0.945，球形液滴。

1.3.3 乳相体积分数测定

观察、记录不同乳液液面高度并拍照。乳析指数(creaming index，CI)的计算方法如公式(1)所示：

(1)

式中：Hc,乳相层的高度，mm；Ht,样品总高度，mm。

1.3.4 乳液流变特性的测定

利用Discovery DHR-2型流变仪测定乳液的流变性能，剪切转子选用40 mm平板，测量温度为25 ℃，选择0.1～1 000 s-1的剪切速率测定乳液的静态剪切流变特性，在1～1 000 rad/s频率内测定弹性模量(G′)和黏性模量(G″)。

1.3.5 β-胡萝卜素含量的测定

准确称取1 g乳液，正己烷+乙醇(3∶2，体积比)混合溶剂连续提取3次，合并上相，定容至10 mL，以正己烷为参比，测定450 nm处吸光度，结果通过标准曲线算出。

1.3.6 乳液氧化稳定性的测定

将制备的乳液分装于样品瓶中，将样品瓶放置于45 ℃下贮存，定期取样测定乳液的氧化程度：过氧化值(peroxide value，POV)。

根据KIOKIAS等[15]的方法，吸取0.5 mL样品乳液，加入5 mLV(异辛烷)∶V(异丙醇)=2∶1的混合溶剂，混合均匀后，在8 000 r/min的转速下离心2 min。吸取2 mL上清液，分别加入20 μL的硫氰酸钾和FeCl2溶液，再用V(甲醇)∶V(正丁醇)=2∶1的混合溶剂定容至5 mL，混合均匀后在室温下避光静置20 min，以V(甲醇)∶V(正丁醇)=2∶1的混合溶剂作空白对照，于510 nm下测定其吸光度。POV计算如公式(2)所示：

(2)

式中：POV,样品的过氧化值，meq/kg；A,样品的吸光度；K,Fe3+标准曲线的斜率(实验计算得到斜率为1.82)；55.86,Fe的原子量；m,称取的样品中油脂的质量，g；0.5,O/Fe的摩尔比；n,吸取上清液的体积分数；2,氧换算为POV值的系数。

1.3.7 体外消化模型的构建

参考YUAN等[16]的方法并稍作修改构建体外消化模型。

模拟口腔消化液：将0.03 g/mL黏蛋白的溶解在pH 7.0的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)中来制备模拟唾液(simulatated saliva fluid,SSF)。将SSF在37 ℃下预热2 min，然后将7.5 mL初始乳液与7.5 mL SSF混合。将样品的pH值调节为6.8，并在37 ℃和100 r/min下孵育10 min。

模拟胃消化液：通过添加2 g NaCl和3.2 g胃蛋白酶制备1 L模拟胃液(simlated gastric fluid,SGF)，然后使用1.0 mol/L HCl将溶液的pH值调节为1.2。将来自口相的样品与SGF以1∶1的体积比混合，然后通过添加1.0 mol/L HCl调节pH值为2。将所得混合物在37 ℃下振荡孵育2 h以模拟胃消化过程。

模拟小肠消化液：将来自胃相的30 mL样品的pH值调节为7.0。然后，将模拟的肠液[2.5 mL酶悬浮液(60 mg胰酶和60 mg PBS中的脂肪酶，pH 7.0)，1.5 mL 盐溶液(36.7 mg/mL CaCl2和218.7 mg/mL NaCl)和3.5 mL的胆盐溶液(PBS含有187.5 mg，pH 7.0)]加入样品中。并将混合体系的pH值调节为7.0，采用光学显微镜放大40倍观察消化过程中乳液形态结构的变化。

1.3.8 β-胡萝卜素的生物可给性测定

以β-胡萝卜素的质量浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制β-胡萝卜素标准曲线，得到线性回归方程Y=0.213 3X+0.028 9，R2=0.999 2。通过测定450 nm处样品吸光度，计算样品中β-胡萝卜素的质量浓度。β-胡萝卜素的生物可给性被认为是来自食品基质或补充剂被掺入混合胶束中并能被肠道吸收的部分[17]。简而言之，将收集的小肠消化液在8 000×g离心30 min。收集透明的胶束相，并根据绘制的标准曲线分析β-胡萝卜素的含量。并根据公式(3)计算β-胡萝卜素的生物可给性:

(3)

式中:C1为样品经过体外消化后β-胡萝卜素的质量浓度(μg/mL)；V1为收集的小肠消化液体积(mL)；C0为样品未经体外消化β-胡萝卜素的质量浓度(μg/mL)；V0为样品未经消化的体积(mL)。

1.4 数据统计分析

所有实验至少重复3次，数据以x±s表示(x为平均值，s为标准偏差，n=3)，并采用 GraphPad Prism 8进行绘图，SPSS 22 软件(IBM，美国)进行方差分析，实验数值间以Duncan法进行显著性差异分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 热稳定性分析

2.1.1 乳析指数分析

乳液的乳析指数是关于乳液中油相和连续相之间平衡稳定状态的指标，是评价乳液物理稳定性的一个非常重要的参数[18]。由图1可知，随着温度升高乳液的乳析指数呈现上升的趋势，在20 ℃时，混合乳液、双层乳液的乳析指数分别为20%、23.3%；而当温度升高的80 ℃时，混合乳液、双层乳液的乳析指数分别为30.8%、26.7%，分别较20 ℃时增大了54%、14.6%，结果表明双层乳液具有较强的热稳定性。随着温度的升高，乳析指数增加可能是受布朗运动和重力等因素的影响，使乳液中的液滴处于连续运动状态而发生相互碰撞导致的[19]。

混-混合乳液；双-双层乳液图1 不同温度处理下乳液的宏观图Fig.1 Macro view of emulsion under different temperature treatments注：乳析指数已在图中标示

2.1.2 β-胡萝卜素保留率分析

由图2可知，2种乳液中β-胡萝卜素的保留率均随着温度的升高而下降。混合乳液在40～80 ℃条件下的保留率分别为76.4%、55.8%、53%，双层乳液在此条件下β-胡萝卜素的保留率分别为91.8%、84.8%、74%。双层乳液对于β-胡萝卜素的保护作用强于混合乳液，其原因为双层乳液表面具有较厚的乳化剂层，可以有效提高双层乳液的稳定性，有效阻隔可以诱导β-胡萝卜素分解的外界因素[17]。而混合乳液对于β-胡萝卜素的保护作用最差，是因为混合乳液形成前，蛋清蛋白Pickering颗粒与壳聚糖发生聚合，具有较大的粒径，无法在乳液表面吸附形成致密的乳化剂层，所以在经过热处理的时候，乳滴热运动加剧，使得乳液容易发生碰撞而破坏乳液表面的结构，从而导致β-胡萝卜素容易接触外界环境而分解。由图1可以看到，随着温度的升高，乳液的颜色随之变浅，说明乳液的中的β-胡萝卜素含量越来越低，即图1的结果与图2中乳液中的β-胡萝卜素的保留率变化相一致。

图2 温度对β-胡萝卜素保留率的影响Fig.2 The effect of temperature on β-carotene retention注：图中不同大/小英文字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

2.2 抗消化稳定性分析

2.2.1 抗消化稳定性分析

使用光学显微镜对β-胡萝卜素乳液在模拟体外消化过程中的微观结构进行观察。由图3可知，与经过口腔消化的乳液相比，2种乳液经过胃消化后仍能保持完整的乳滴结构。但是经过胃消化120 min后，混合乳液中液滴的密度明显下降，还出现了大量较大粒径的乳滴。其原因为混合乳液表面的蛋清蛋白凝胶颗粒与壳聚糖分子无序吸附在乳滴表面，液滴表面的乳化剂在极酸性环境下与胃蛋白酶、电解质(Na+、K+、Cl-等)混合，造成界面层被破坏[20]。而双层乳液经过胃消化过程后乳滴密度也稍有减小，乳液粒径略微增大，说明双层乳液在强酸环境中具有较好的稳定性。混合乳液则在小肠消化90 min后出现破乳现象；而双层乳液在整个小肠消化过程中保持完整的乳液结构，但是乳液的粒径明显增大，其原因为双层乳液具有较厚的界面层，可以有效减乳液结构被破坏[21]。

2.2.2 生物可给率分析

在小肠消化阶段，由于载体油的水解，包埋在乳液中的营养物质会被释放，并溶解在胆汁盐胶束中，进而被小肠吸收[22]。混合乳液、双层乳液中β-胡萝卜素的生物可给率分别为25.5%、40.2%。结果表明，通过构建蛋清蛋白-壳聚糖双层乳液递送载体可以有效提高β-胡萝卜素的生物可给率。其原因为经过体外消化后，消化液中的脂肪酶、胆盐等可与乳液体系中的乳化剂发生竞争性取代，吸附于乳滴表面，分解油脂，释放β-胡萝卜素，被小肠细胞吸收利用[17]。而双层乳液仍能保持完整的乳液结构，具有较大的比表面积，有利于脂肪酶、胆盐等吸附，促进脂溶性胶束的形成，从而提高β-胡萝卜素的生物可给率；而混合乳液经过小肠消化后，乳液结构被破坏，具有较小的比表面积，油脂的分解速度较慢，进而抑制脂溶性胶束的形成。双层乳液具有较高的生物可给率的原因还可能为双层乳液具有较强的稳定性，经过肠胃消化仍能保持完整的乳液结构，隔绝外界环境，防止乳液中β-胡萝卜素的降解，而混合乳液在消化过程中出现破乳现象，油脂发生聚集而与外界环境直接接触，导致β-胡萝卜素发生降解。

2.3 贮藏稳定性分析

2.3.1 乳液粒径分析

由图4可知，乳液的粒径均随着贮藏时间的延长，乳液的粒径显著增大(P<0.05)。新鲜制备的混合乳液、双层乳液的粒径分别为99.5、77.4 μm，在贮藏15 d后，乳液的粒径分别为129.5、89.8 μm，分别较新鲜乳液增大了30.2%、16.1%。其中，双层乳液的稳定性最好，而混合乳液的稳定性最差；其原因为混合乳液表面的乳化剂为蛋清蛋白Pickering颗粒与壳聚糖分子通过静电作用形成的复合物，粒径较大，无法再油滴表面形成致密的保护膜，且乳液表面的电势很小，乳滴之间的静电斥力较小，所以在贮藏期间乳液在发生运动时容易发生碰撞，然后聚合形成粒径较大的乳液；而双层乳液则是油滴表面具有2层乳化剂薄膜，可以有效减小乳滴在碰撞过程中的聚合机率，减缓乳滴粒径增大的速度[3]。

a-混合乳液；b-双层乳液图3 乳液体外消化过程中的微观结构Fig.3 Microstructure of emulsion in vitro digestion注：图中放大倍数为40倍

图4 不同种类乳液贮藏期间粒径变化Fig.4 Changes in particle size of different types of emulsions during storage

2.3.2 β-胡萝卜素保留率分析

由图5可知，负载β-胡萝卜素的2种不同乳液中β-胡萝卜素的的保留率随着时间的延长均显著下降(P<0.05)。在第3天时，2种不同种类乳液中β-胡萝卜素的保留率分别为78.3%、85.1%。在贮藏15 d后，2种乳液中β-胡萝卜素的保留率分别为32%、50.3%。其中，混合乳液中β-胡萝卜素的保留率低于双层乳液，这种现象主要归因于混合乳液的不稳定性，表面的稳定剂层容易被破坏，双层乳液的乳滴表面具有致密的双层乳化剂膜，可以有效阻隔可以诱导β-胡萝卜素分解的外界因素。此外，有研究表明β-胡萝卜素的保留率随着乳液粒径的减小而增加[23]。由此可见，双层乳液对于β-胡萝卜素的保存效果最好。

图5 贮藏期间乳液中β-胡萝卜素保留率的变化Fig.5 Changes in β-carotene retention rate in emulsion during storage

2.3.3 氧化稳定性分析

2种乳液中POV的含量随着贮藏时间的变化如图6所示。乳液中油脂的POV值均随着氧化时间的延长而显著增加(P<0.05)，说明乳液的氧化稳定性降低。在第15天时，负载β-胡萝卜素的混合乳液和双层乳液中油脂的POV值分别为62.7、39.3 meq/kg。由此可见，双层乳液中油脂氧化稳定性优于混合乳液。其原因为双层乳液表面电势接近于0或者带正电，与连续相中同样带正电的促氧化剂发生排斥反应，减缓乳液中的油脂与促氧化剂接触而发生氧化[24]。同时，双层乳液表面的界面膜层数以及厚度的增加可以为油-水界面提供极强的界面屏障，进一步抑制了油脂与促氧化剂发生氧化反应。而混合乳液表面的蛋清蛋白颗粒与壳聚糖形成的聚合物粒径较大，乳滴表面无法形成致密的保护膜，乳液中的油脂容易接触连续相中的促氧化剂，导致混合乳液的氧化稳定性最差。

图6 不同种类乳液贮藏期间氧化稳定性变化Fig.6 Changes in oxidation stability of different types of emulsions during storage

3 结论

本研究对比了蛋清蛋白-壳聚糖混合乳液与蛋清蛋白-壳聚糖双层乳液负载β-胡萝卜素后，其热稳定性、抗消化稳定性和贮藏稳定性的变化。结果表明，热处理后双层乳液的粒径变化更稳定，且80 ℃处理后双层乳液的β-胡萝卜素的保留率更高，表现出较强的热稳定性。在体外消化过程中，双层乳液的抗消化稳定性更好。在贮藏期间，双层乳液能够较好地保留β-胡萝卜素，且在贮藏15 d时，负载β-胡萝卜素的双层乳液中油脂的POV值较混合乳液低23.4 meq/kg。因此，双层乳液有利于抵抗环境因素如温度、光照等的影响，可以在一定程度上延缓生物活性物质的降解，双层乳液的制备为生物活性物质的递送提供了一种新的思路。