葡萄MAPK基因家族鉴定及逆境胁迫下的表达分析

马宗桓,黄青勇,李艳梅,李文芳,毛 娟,陈佰鸿

(甘肃农业大学 园艺学院,兰州 730070)

植物促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是细胞信号转导中极为重要的一类蛋白激酶,含有11个高度保守的亚结构域[1]。MAPK是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者,所有的真核细胞都能表达MAPK,能被不同的细胞外刺激,如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附[2]。MAPK信号通路一般包括功能相互关联的3个蛋白激酶:促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPK/MAP3K/MEKK)、促分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPK/MAP2K/MAKK)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK/MPK)。研究表明MAPKKKs、MAPKKs和MAPKs都是多基因家族。例如,拟南芥基因组中含有20个MAPK,10个MAPKK,80个MAPK K K基因[3-4]。MAPKKK通常作用于MKK的S/T-xxxxx-S/T(S、T和x分别表示丝氨酸、苏氨酸和任意氨基酸)位点将其磷酸化并激活,随后,活化的MKK磷酸化MAPK的苏氨酸和酪氨酸残基(TXY)从而激活MAPK,MAPK能将细胞膜表面受体感知到的信号通过磷酸化和去磷酸化作用进行逐级放大并传递到细胞内,靶向激活胞质或核内的其他激酶、酶或转录因子等效应蛋白,调节特定基因的表达,从而促使细胞、组织、器官、整个生物体作出相应的生理生化反应,进而适应环境和抵御逆境胁迫[2-4]。

MAPK信号途径在植物响应生物和非生物胁迫中发挥着重要作用[5],例如拟南芥中,At-MPK1和At MPK4参与调节系统抗性[6-7],烟草中,MAPK基因能被各种生物胁迫和防御激素所激 活[8]。水 稻 中,OsBWMK1、Os MAPK3、Os-MAPK5和Os MPK8被证实与抗病性、激素信号及非生物胁迫相关[9-10]。紫花苜蓿中,MAPK级联反应能被真菌诱导子激活,也参与非生物胁迫响应[11]。

本研究拟对葡萄MAPK基因家族进行生物信息学及不同非生物胁迫下的表达水平分析,以期为葡萄抗逆基因的筛选提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验材料为保存在甘肃农业大学果树生理与生物技术实验室的‘黑比诺’葡萄(Vitis viniferaPinot noir)试管苗,2021年3月将保存试管苗的单芽茎段接种于GS液体培养基中,培养基添加0.2 mg·L-1IAA,p H 5.8～6.0,温度25℃/20℃(光照/黑暗),光周期16 h/8 h(光照/黑暗)。采用纸桥法进行固定,培养30 d后,试管苗高度达到12 cm左右,挑选生长状况一致且无污染的葡萄试管苗作为试验材料进行处理。处理方式为小心倒出原培养基,再重新分别加入50 m L含10% PEG、500μmol·L-1ABA和200 mmol·L-1NaCl的GS液体培养基,每个处理设置3组重复,对照加入等体积液体培养基,处理24 h后提取试管苗总RNA。

1.2 葡萄MAPK基因家族序列数据获取

从拟南芥基因组数据库TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中下载拟南芥MAPK基因的氨基酸序列;从水稻基因组网站RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)

下载水稻的氨基酸序列。将已获得的拟南芥和水稻的氨基酸序列作为诱饵序列在葡萄基因组数据库(https://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/)中进行Blat-Search,搜索得到葡萄MAPK基因,然后通过SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)和Pfam网站(http://pfam.xfam.org/)确认是否含有MAPK保守结构域,去除结构域缺失或不完整的序列,从而确定最终的候选基因。下载基因的全长,CDS序列,氨基酸序列。

1.3 葡萄MAPK家族成员生物信息学分析

利用Ex PASy数据库(https://web.expasy.org/protparam/)中的ProtParam工具进行蛋白质的理论等电点、氨基酸大小、分子量等基本信息的分析;利用Maplnspect软件进行基因染色体上的位置分析。利用MEGA 7.0软件进行葡萄MAPK家族成员的进化分析;运用Predict Protein(http://www.predictprotein.org/signin#)

在线分析蛋白质二级结构域;在线软件GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)进行基因结构分析;使用DNAMAN进行结构域序列多重比对。

1.4 葡萄MAPK家族基因芯片表达模式分析

利用PLExdb软件(http://www.plexdb.org/index.php)进行MAPK家族RNA-Seq数据获得,以核酸为探针探索出相似度最高Affytmetrix Gene Chip 16K基因ID,然后利用检索到的ID(例如:1622318-at)在Excel中分别提取各成员在盐、PEG、冷害以及ABA胁迫下的RNA-Seq数据,再对数据进行ln函数转换。最后使用Heml1.0.3.7软件进行热图制作。组织特异性表达数据来自平台(GPL13936 NimbleGen 090918 Vitus vinifera exp HX12[090918_Vitus_exp])(登录号:GSE36128),选取的数据来自葡萄不同时期的器官,利用TBtools绘制热图。

1.5 葡萄MAPK家族成员q RT-PCR分析

将葡萄MAPK基因家族的CDS序列提交到生工生物工程(上海)股份有限公司网站进行在线引物设计。以提取的总RNA为模板,用Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)试剂盒进行cDNA第1链的合 成,将0.5～2μg纯化 的总RNA反转录成第1链c DNA,作为基因扩增及实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)的模板。其中,试验中应用实时荧光定量PCR仪(LightCycler96 Real-Time PCR System,Roche,瑞士),使用SYBR GreenⅠ(Ta KaRa)试剂盒。以葡萄GAPDH基因为内参,扩增体系含2μL cDNA,0.8μL上、下游引物(表1),10μL反应MIX,6.4μL dd H2O,总体积20μL。反应程序为:95℃下变性30 s,95℃变性5 s,60℃下 退 火30 s,40个 循 环;95℃15 s,60℃30 s,95℃15 s。反应结束后分析荧光值变化曲线及熔解曲线。基因的相对表达量采用2-ΔΔCt计算。

表1 葡萄MAPK家族表达分析的实时荧光定量引物Table 1 qRT-PCR primers for expression analysis of MAPK in grape

1.6 数据统计与分析

用Origin 9.0软件对数据进行整理和作图,用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析,采用最小显著差异法(LSD)比较不同数据组间的差异,每个处理设置3个生物学重复,显著性水平设定为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 葡萄MAPK家族基因理化性质分析

利用拟南芥和水稻MAPK氨基酸序列在葡萄基因组网站中Blat搜索到43个葡萄MAPK基因,分别命名为Vv MAPK1～Vv MAPK43。葡萄MAPK家族氨基酸大小为114～1 520 aa,Vv MAPK20氨基酸序列最长,有1 520个氨基酸残基。Vv MAPK23氨基酸序列最短,只有114个氨基酸残基。分子质量为12.26～169.94 ku。等电 点 集 中 在4.94～10.01之 间,其 中Vv MAPK17的等电点最低,Vv MAPK23等电点最高(表2)。葡萄MAPK家族成员不均匀的分布在葡萄的15条染色体上,其中第5号染色体和第18号染色体分布的基因最多,第1、7、8、11号染色体上仅有1个基因(图1)。

表2 葡萄MAPK家族理化性质分析Table 2 Information and physicochemical properties of grape MAPK gene family

图1 葡萄MAPK家族染色体定位Fig.1 Chromosome mapping of grape MAPK gene family

2.2 葡萄Vv MAPK家族基因结构与进化分析

葡萄MAPK基因结构分析表明,43个Vv MAPK基因内含子和外显子含量差异较大,整个基因家族的外显子数在1到17个不等。其中10个基因不含有上游和下游基因序列,分别是Vv MAPK5、Vv MAPK8、Vv MAPK15、Vv MAPK28、Vv MAPK30、Vv MAPK37、Vv MAPK38、Vv MAPK39、Vv MAPK40和Vv MAPK43。7个基因仅含有一个外显子,分别是Vv MAPK3、Vv MAPK14、Vv MAPK21、Vv MAPK23、Vv MAPK24、Vv MAPK25和Vv MAPK36(图2)。利用MEGA 7.0构建系统进化树,结果如图3所示,葡萄MAPK家族可分为2个亚族,第Ⅰ亚族共有10个成员,第Ⅱ亚族有33个成员。其中Vv MAPK1和Vv MAPK33、Vv MAPK24和Vv MAPK25、Vv MAPK30和Vv MAP32的亲缘关系较为紧密。Vv MAPK29和Vv MAPK22、Vv MAPK34和Vv MAPK10亲缘关系较近。

图2 葡萄MAPK家族基因结构分析Fig.2 Gene structure analysis of grape MAPK family

图3 葡萄MAPK家族成员进化分析Fig.3 Evolution analysis of grape MAPK gene family

2.3 葡萄MAPK家族成员基因芯片数据分析

基因芯片表达分析发现,经ABA处理后,Vv MAPK5、Vv MAPK7和Vv AMAPK13基 因的表达量明显下调表达,而其他基因表达量不太明 显。当 在 盐、PEG、低 温 处 理 条 件 下,Vv MAPK6、Vv MAPK9和Vv MAPK13的 表 达量明显上调;Vv MAPK1的表达量明显下调。此外,不同时间的逆境胁迫对葡萄MAPK基因家族的表达存在不同的影响。如Vv MAPK5、Vv MAPK6和Vv MAPK7在盐和PEG处理24 h之后的表达量明显高于CK1(图4)。

图4 非生物胁迫下葡萄MAPK基因表达谱Fig.4 Expression profile of MAPK gene in Vitis vinifera

从葡萄eFP浏览器数据库中搜索得到43个葡萄MAPK基因,用TBtools将这些基因在不同组织的不同生长阶段的表达进行可视化作图(图5)。总体来看,Vv MAPK在不同组织以及不同组织的不同生长阶段存在显著的表达差异,其中Vv MAPK17、Vv MAPK14、Vv MAPK15和Vv MAPK28在结果时期的叶片中表达量最高,预示这些基因可能在葡萄果实发育中起到重要作用。Vv MAPK 15、Vv MAPK 23、Vv MAPK 24、Vv MAPK25和Vv MAPK36在衰老的叶片中表达 量 较 高,Vv MAPK22、Vv MAPK19、Vv MAPK9和Vv MAPK37的表达量随着种子的发育显著增高,表明这些基因在葡萄种子发育过程中可能发挥重要作用。此外,在葡萄茎的发育过程中,Vv MAPK4、Vv MAPK16、Vv MAPK18、Vv MAPK20的表达显著升高。大多数基因在发育过程中不同组织的表达水平相对较低。

图5 葡萄MAPK基因组织特异表达谱Fig.5 Tissue specific expression profile of MAPK gene in grape

2.4 葡萄MAPK基因顺势作用元件分析

为了分析葡萄Vv MAPK基因家族可能参与的生物学调控,对该基因家族的起始密码子上游2 kb序列进行分析。发现Vv MAPK基因的启动子中均含有不同类型的顺式作用元件,分别有响应激素信号、干旱、低温、光照的顺式作用元件,并且43个基因所分布的作用元件较为均匀。其中响应光信号的作用元件在所有基因中分布相对均匀。有5种激素相关的顺式作用元件在Vv MAPK基因家族的启动子中鉴定出来,其中Vv MAPK18、Vv MAPK19和Vv MAPK20中响应ABA的作用元件分布较为集中,响应IAA的元件多集中分布在上游1 500～2 000 bp的基因序列中(图6)。

图6 葡萄MAPK基因顺势作用元件Fig.6 Expression profile of MAPK gene in Vitis vinifera

2.5 葡萄MAPK基因的实时荧光定量分析

VvMAPK基因家族各成员受200 mmol·L-1NaCl、500μmol·L-1ABA和10% PEG的 诱导,各处理间表达量具有明显的差异,Vv MAPK9、Vv MAPK27和Vv MAPK29、VvMAPK38和VvMAPK42分别在200 mmol·L-1NaCl、500μmol·L-1ABA和10%PEG处理后表达水平均显著上调,Vv MAPK42在10%PEG处理后表达水平上调最为显著,为CK的5.5倍,其他几个成员在200 mmol·L-1NaCl处理后表达水平上调显著,Vv MAPK27和Vv MAPK38分别为CK的3 500倍和140倍。Vv MAPK5、Vv MAPK12、Vv MAPK13、Vv MAPK23、Vv MAPK24、Vv MAPK26、Vv MAPK28、Vv MAPK35、Vv MAPK39和Vv MAPK41对200 mmol·L-1NaCl胁迫反映强烈,与对照相比,显著上调表达,Vv MAPK7在10% PEG处理后上调表达显著。Vv MAPK9、Vv MAPK12、Vv MAPK27、Vv MAPK29、Vv MAPK38、Vv MAPK39和Vv MAPK42在500μmol·L-1ABA处理后相比对照上调表达显著,而Vv MAPK5、Vv MAPK7和Vv MAPK23表达水平显著下调。Vv MAPK13、Vv MAPK24、Vv MAPK26、Vv MAPK35和Vv MAPK41在500μmol·L-1ABA和10%PEG处理后表达均显著下调(图7)。

图7 葡萄MAPK基因家族荧光定量表达分析Fig.7 Fluorescence quantitative expression analysis of MAPK gene family in Vitis vinifera

3 讨论与结论

MAPK基因还有一个MAPK级联途径,包括MAPKKK(MAP3K或MEKK)、MAPKK(MAP2K或MKK或MEK)、MAPK(MPK)3组成员,是真核生物中广泛存在且高度保守的信号转导途径,参与植物细胞分化与发育[12-13]、成熟、激素信号转导及免疫等过程[14-15]。同时,响应多种生物与非生物胁迫[16-17]。本研究通过已知拟南芥和水稻MAPK蛋白序列从葡萄基因组数据库中同源搜索到43个Vv MAPK基因,而基因结构和进化树分析显示这些成员可以归到2个亚族。不同成员在细胞内的定位都不一样,主要有叶绿体、细胞质、细胞核、细胞质、细胞膜上。亚细胞定位可反映出成员潜在的功能,比如定位于线粒体中的MAPK主要用于清除脂肪酸β氧化物产生的过氧化氢,而定位于叶绿体中的MAPK主要用于保护光和活性氧免受活性氧的危害[18]。葡萄MAPK蛋白主要在叶绿体、线粒体和细胞核中进行表达,因此说明这个MAPK基因家族主要集中在光合作用,呼吸作用代谢比较强的器官当中。

植物MAPK基因在不同的器官和组织中呈现出特定的时空表达特性,Zhang等[19]从葡萄叶片分离到一个受高温胁迫的MAPK(Vv MPK6)基因,并在根、茎、叶、花、果实和种子中均有表达。辣椒Ca MPK9在叶中的表达水平高于其他器官[1];棉花中Gb MPK3在根、花瓣、花药和纤维中呈现高表达,而在叶片中则几乎检测不到[20]。燕山葡萄中Vy MAPK2主要在根中表达,Vy-MAPK3主 要 在 叶 中 表 达[18]。本 研 究 中Vv MAPK17、Vv MAPK14、Vv MAPK15和Vv MAPK28在结果时期的叶片中表达量最高,Vv MAPK15、Vv MAPK23、Vv MAPK24、Vv MAPK25和Vv MAPK36在衰老的叶片中表达 量 较 高,Vv MAPK22、Vv MAPK19、Vv MAPK9和Vv MAPK37的表达量随着种子的发育显著增高,暗示不同成员在器官发育中参与了相关的生理活动。

植物体本身具有一些特异性方面相关的调控机制,通过信号方式,调控一系列相关抗性基因的表达,从而可以提高植物在抵御逆境胁迫中的能力[21]。研究表明,Vv MPK6基因在植物的生长发育过程中会受到极端环境温度、干旱、盐害以及渗透胁迫等非生物胁迫的相关调控[19]。拟南芥中,NaCl处理能在短时间内激活At MPK6基因,增强植物的抗盐性[22]。Singh等[23]发现外源生长素及细胞分裂素处理可以诱导水稻Os MAPKK3/6和Os MAPK3/6基因的表达。本研究对葡萄试管苗进行非生物胁迫处理,研究了MAPK家族成员的响应情况。对随机选取的19个葡萄MAPK基因家族成员进行非生物胁迫表达分析,发现大多数成员均对NaCl胁迫反应敏感,Vv MAPK5、Vv MAPK12、Vv MAPK13、Vv MAPK23、Vv MAPK24、Vv MAPK26、Vv MAPK28、Vv MAPK35、Vv MAPK39和Vv MAPK41对200 mmol·L-1NaCl胁迫反映强烈,与对照相比,上调表达显著,Vv MAPK27和Vv MAPK38分别为CK的3 500倍和140倍,说明该基因家族成员在葡萄抗盐碱方面作用明显。Gang等[24]发 现 除Vv MAPK14、Vv MAPK31和Vv MAPK41外,其他基因至少可以响应一种逆境胁迫。Vv MAPK12、Vv MAPK1、Vv MAPK10、Vv MAPK17、Vv MAPK26、Vv MAPK32和Vv MAPK21分别响应光和水杨酸胁迫,Vv MAPK21、Vv MAPK18和Vv MAPK19能够响应9种胁迫,Vv MAPK23受到光胁迫的强烈诱导。本研究中Vv MAPK9、Vv MAPK27和Vv MAPK29、Vv MAPK38和Vv MAPK42在200 mmol·L-1NaCl、500μmol·L-1ABA和10%PEG处理后表达水平均显著上调,Vv MAPK13、Vv MAPK24、Vv MAPK26、Vv MAPK35和Vv MAPK41在500μmol·L-1ABA和10%PEG处理后表达均显著下调,不同的基因对非生物胁迫响应也不尽相同。芯片数据显示,ABA处理后Vv MAPK5和Vv MAPK7在ABA处理后表达量明显下调,Vv MAPK9敏感响应NaCl和PEG胁迫,与本研究结果一致。Vv MAPK12、Vv MAPK16和Vv MAPK22在PEG处理后芯片表达数据和qRT-PCR结果不同,造成差异的主要原因可能与试验材料的生长状况、条件和品种有关,本研究主要以试管苗为研究材料,在生理状态上和室外生长的苗木有较大的差别,从而影响到试验结果。

综上,在葡萄基因组中检索获得43个MAPK成员,并且大多数受到200 mmol·L-1NaCl的诱导,表达水平较对照上调显著,Vv MAPK9、Vv MAPK27、Vv MAPK29和VvMAPK38在500μmol·L-1ABA、200 mmol·L-1NaCl和10%PEG处理后均上调表达显著,对3种非生物胁迫的响应强烈。