促进水稻耐盐碱细菌S4菌株的筛选鉴定及其效果研究

李 壮,吴凯华,齐玉玺,季鸿飞,张慧兄,刘 艳,杨国平,,3,张 琇,3

(1.北方民族大学 生物科学与工程学院,银川 750021;2.宁夏五丰农业科技有限公司,银川 750021;3.宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室,银川 750021)

随着经济和社会的发展,国内人口基数不断增大,与不断减少的耕地之间矛盾愈加突出,粮食安全问题已经成为国家战略安全问题[1-2]。中国约有4.5亿亩水稻田,水稻作为中国人最重要的粮食作物,在农业发展和粮食安全上一直占据重要地位[3]。水稻田面积的减少和次生盐渍化严重威胁中国的粮食安全,故人们开始将目光转向在盐碱地这一重要的潜在土地资源上种植水稻[4-5]。中国约有3.6×107hm2盐碱地和2.0×106hm2沿海滩涂[6-7],大力开展耐盐碱水稻(俗称海水稻)的育种和在沿海滩涂地带以及内陆盐碱地上试种耐盐碱水稻,便是中国利用盐碱地资源和解决粮食问题的新尝试。

自然界中存在可刺激植物提升抗逆(如盐碱、干旱、洪涝、冻害等)能力的根际微生物和内生微生物[8-12],但人们对这些特殊微生物知之甚少。近年来,植物耐盐碱研究大多局限于植物对盐碱胁迫的生理生化反应,例如在盐碱胁迫下植物的过氧化氢酶活性升高、积累某些氨基酸等,这些研究只涉及植物和盐碱等方面[13-14]。而微生物的接种可使不耐盐碱的植物提升一定的耐盐碱能力,形成独特的“植物-微生物-盐碱”模式,而这三方面的相互作用鲜见报道。此外,如何高效筛选更多有效促进植物耐盐碱的菌株,并揭示此类微生物提高植物耐受能力作用机理的研究更为欠缺。本研究通过模拟自然界盐碱胁迫条件,筛选增强水稻在盐碱胁迫下生长能力的微生物,通过接种微生物,开辟在不改变盐碱地的情况下仍可让作物生长良好的新型盐碱地利用模式,避免传统盐碱地治理方法的高投入低回报弊端,其具有较大的商业应用价值,并为提高盐碱地资源的利用、解决人口与耕地间的矛盾提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物品种 水稻(Oryza sativaL.)品种为耐盐碱水稻‘湘两优900’(由湖南年丰种业公司提供,特此感谢)。

1.1.2 土壤样品采集 土壤样品取自宁夏回族自治区盐碱地不同植物根系(表1)。

表1 土样取样地基本情况Table 1 Basic information of sampling sites

1.1.3 植物营养母液的配置(1 000×) 植物营养母液的配置参照刘环等[15]的方法。

母液各取1 m L加入少量蒸馏水中定容至1 000 m L,1×105Pa灭菌20 min即为常规植物营养液。

1.1.4 盐碱胁迫营养液 在常规植物营养液中加入5.50 g NaCl,经1×105Pa灭菌20 min后,加入适当浓度经灭菌的Na2CO3溶液,调节p H至8.5,即为盐碱胁迫营养液。

1.1.5 TSN固体培养基 胰蛋白胨1.70 g,大豆蛋白胨0.33 g,氯化钠5.5 g,磷酸氢二钾0.25 g,葡萄糖0.25 g,蒸馏水1 000 m L,琼脂12.0 g,经1×105Pa灭菌20 min。

1.1.6 DTSA培养基 胰蛋白胨1.70 g,大豆蛋白胨0.33 g,磷酸氢二钾0.25 g,葡萄糖0.25 g,琼脂12.0 g,蒸馏水1 000 m L,经1×105Pa灭菌20 min。

1.1.7 DTSB培养基 胰蛋白胨1.70 g,大豆蛋白胨0.33 g,磷酸氢二钾0.25 g,葡萄糖0.25 g,蒸馏水1 000 m L,经1×105Pa灭菌20 min。

1.1.8 初筛培养基 常规植物营养培养基:常规植物营养液中加入6.5 g/L琼脂,1×105Pa灭菌20 min;盐碱胁迫培养基:盐碱胁迫营养液中加入6.5 g/L琼脂,1×105Pa灭菌20 min,凝固前加入适量灭菌的Na2CO3溶液即为盐含量0.60%,p H 8.5的盐碱胁迫培养基。

1.1.9 催芽培养基 琼脂6.5 g,蒸馏水1 000 m L,经1×105Pa灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离纯化 分别取表1中10 g根际土壤碾碎后加入装有90 m L蒸馏水的烧杯中,振荡30 min,取悬浊液逐级梯度稀释,将适宜浓度的稀释液涂布于TSN固体培养基平板上,28℃倒置培养24～72 h,挑取各分离物划线纯化3次,获得纯化菌株保存于4℃,备用。

1.2.2 种子催芽 取大小均一、颗粒饱满无破损的水稻种子经55℃、10 min热处理后,在超净工作台中用无水乙醇浸泡5 s,用0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒30 s,再用无菌水冲洗6次。均匀摆放于催芽培养基上,于28℃黑暗条件下培养2 d萌发,待水稻幼芽长至0.5～1.0 cm,备用。

1.2.3 初筛 通过盐碱胁迫平板筛选可刺激水稻幼苗耐盐碱的菌株,设置3种处理,无盐碱胁迫对照CK0:催芽后的种子均匀摆放于常规植物营养培养基上;盐碱胁迫对照CK1:催芽后的种子均匀摆放于盐碱胁迫培养基上;测试处理:催芽后的种子用待测菌株配置的菌悬液浸泡1 min后均匀摆放在盐碱胁迫培养基上,菌悬液浓度为1×108cfu/m L。每平板25粒种子,每处理设置3个重复,置于光照培养箱中,培养方式参照表2。

1.2.4 复筛 水培法筛选可提高促进水稻耐盐碱能力的菌株:水稻种子催芽后挑选长势均一的水稻幼芽,均匀摆放在盛有300 g白色鹅卵石(直径0.4～0.7 cm)经1×105Pa灭菌20 min的植物培养瓶中,各培养瓶中加入60 m L植物营养液,并在每瓶摆放25粒水稻幼芽。CK0:常规植物营养液,不接菌处理;CK1:盐碱胁迫营养液,不接菌处理;测试组:盐碱胁迫培养基,种子浸泡于1×108cfu/m L浓度的待试菌悬液1 min后种植。

每处理设置3个重复,放置光照培养箱中,按表2方式培养,每天测定并矫正营养液盐度和p H,14 d后采集水稻幼苗株高、根长和鲜质量等生长指标,筛选出可显著提升水稻耐盐碱能力的菌株。

表2 水稻幼苗培养条件Table 2 Cultivation condition of rice seedlings

1.3 菌株的鉴定

1.3.1 培养特征和形态特征观察 将S4菌株划线接种在TSN培养基上,28℃培养72 h后观察记录单菌落形态,并采用革兰氏染色法观察细胞形态。

1.3.2 分子鉴定 将S4菌株送至北京睿博兴科生物技术有限公司测定16S r RNA序列,根据同源性进行菌株鉴定。

1.3.3 S4菌株生长曲线的测定 将S4菌株划线接种在DTSA培养基上,28℃培养24 h。挑取单菌落用无菌水制成1×108cfu/m L菌悬液,取1 m L菌悬液,加入装有100 m L DTSB培养液的250 m L锥形瓶中,180 r/min,28℃振荡培养,每隔2 h取样。在600 nm下(以不接菌DTSB培养液为空白对照)测定吸光值。

1.3.4 S4菌株对盐、碱、高温耐受性 将S4菌株划线接种在DTSA斜面上,28℃培养24 h。

用无菌水制成1×108cfu/m L菌悬液,取1 m L菌悬液分别加入装有100 m L含有0、5%、10%、15%、20%、25% NaCl的DTSB培养液的250 m L锥形瓶中,180 r/min,28℃振荡培养72 h,在600 nm下(以不接菌培养液为空白对照)测定吸光值。

用无菌水制成1×108cfu/m L菌悬液,取1 m L菌悬液,加入装有100 m L DTSB培养液的250 m L锥形瓶中,p H分别调节为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0,180 r/min、28℃振荡培养72 h,在600 nm波长条件下以不接菌培养液为空白对照测定吸光值。

用无菌水制成1×108cfu/m L菌悬液,取1 m L菌悬液加入装有100 m L DTSB培养液的250 m L锥形瓶中,180 r/min,分别置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条 件 下 振 荡 培 养72 h,在600 nm波长下(以不接菌培养液为空白对照)测定吸光值。

1.4 大田试验

试验区位于宁夏银川市西夏区贺兰山西路芦花村(108°9′13″E、38°34′45″N,海拔111 7 m)。采用旱育稀植和全程机械化栽培,以常规方式进行底肥、分蘖肥、穗肥和粒肥的施加。试验设置2个处理,测试组:S4菌剂拌种+常规管理;对照组:常规管理。各组设置6个重复,共计12个小区,小区面积13 225 m2(115 m×115 m),小区随机区组排列,小区间打埂隔离。

1.4.1 试验区肥力指标检测 主要检测总有机质、全氮、速效氮、速效磷、速效钾、土壤盐分和p H等对水稻生长有重要影响的指标,检测方法参照农业部标准NY/T 1121-2006、NY/T 53-1987和NY/T 889-2004等。

1.4.2 S4菌株在盐碱土中对水稻生长的影响收获期每小区随机选取50株水稻植株,对株高、分蘖数、剑叶长度等生长指标和单穗质量、有效穗数、千粒质量等产量指标进行测定。

1.5 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2016和Graphpad Prism 8.0进行数据处理和统计,5%显著水平,并用Microsoft Excel 2016进行绘图,数据以“平均数±标准差”形式表示。

2 结果与分析

2.1 促进水稻耐盐碱菌的筛选

从植物根际土壤和植物组织中分离得到450株细菌、放线菌,共筛选出效果较为明显且稳定的6株供试菌株。在盐碱胁迫条件下分别接种6种菌株相对于对照组(不接种菌株),水稻幼苗的株高、根长、鲜质量和干质量均有不同程度的提升,说明上述6株菌株对水稻幼苗在盐碱环境的生长具有促进作用,可不同程度地提升水稻幼苗对盐碱胁迫的抵御能力(表3)。通过3次重复共培养试验,发现菌株S4对盐碱胁迫下水稻幼苗生长的 促生效果最为显著而稳定(图1)。

表3 接种菌株14 d后水稻幼苗生长状况Table 3 Growth status of rice seedlings after strains inoculation for 14 days

图1 不同处理下水稻幼苗生长情况对比Fig.1 Comparison of growth of rice seedlings under different treatments

2.2 菌株S4的鉴定

2.2.1 培养特征和形态学观察 S4菌株在TSN培养基上的菌落为圆形,直径1.5 mm,菌落颜色因培养条件不同而变化,在黑暗条件下生长的菌落为乳白色,在光照条件下培养的菌落为淡黄色,表面光滑有光泽,有粘性易挑起。菌落切面隆起,不透明,边缘完整或波状(图2-A、图2-B),为革兰氏阳性菌(图2-C)。

图2 S4菌株的菌落形态和菌株特征Fig.2 Colony morphology of strain S4

2.2.2 菌株S4分子鉴定 根据16S r RNA鉴定,S4菌株为人参土微杆菌(Microbacterium ginsengiterrae),相似性达99.14%,获得序列号NR116483.1。

2.2.3 菌株S4生长曲线 随着培养时间的增加,S4菌株的OD600在0～14 h增加缓慢,即菌体数增加缓慢;而在16～20 h,S4菌株的OD600呈现指数增长趋势,表明此时菌体增长量大,活力最旺盛,在其生长期内此时期最适宜对种子进行接种(图3)。

图3 菌株S4生长曲线(n=3)Fig.3 Growth curve of strain S4(n=3)

2.2.4 菌株S4对盐、碱及高温的耐受能力 经试验测定(图4),S4菌株在盐含量达到4.0%时生长状态最为良好,而其最大耐盐含量为5.0%;p H在9.5时生长最佳,但p H达到10.5时无法生长;最适生长温度在30～31℃,最高耐受温度为50℃。

图4 S4菌株对逆境的耐受能力(n=3)Fig.4 Tolerance of strain S4 to adverse conditions(n=3)

2.3 S4菌株对水稻植株在盐碱土中生长的影响

2.3.1 试验区肥力指标检测 试验区土壤肥力指标中有机质和全氮含量较高,参照全国第2次土壤普查推荐的土壤肥力分级标准,速效氮、速效磷和速效钾含量为第3级,表明土壤肥力较好,但盐分和p H较高,对作物生长不利(表4)。

表4 田间试验区土壤肥力指标Table 4 Soil fertility index in field of trial area

2.3.2 S4菌株在盐碱土中对水稻生长的影响与对照组相比,施用S4菌剂对水稻植株剑叶长度的促进作用不显著,但在株高、分蘖数、穗长和地上部分干质量等生长指标方面分别提高8.46%、72.91%、12.74%和66.85%,而在单穗质量、有效穗数、穗粒质量、出谷率、千粒质量和理论亩产等产量指标方面,相对对照组水稻植株分别提高13.33%、18.31%、18.43%、5.24%和10.79%(图5、表5、表6)。

表5 施用S4菌剂后水稻植株生长状况Table 5 Growth status of rice after application of S4 inoculum

表6 施用S4菌剂后水稻产量指标变化Table 6 Changes of rice yield indexes after application of S4 inoculum

图5 不同育苗方式下水稻生长状况对比Fig.5 Comparison of rice growth status with different seedling raising methods

3 讨论

近年来,通过微生物方法改良土壤盐渍化已成为人们关注的热点,但通过微生物刺激提高水稻耐盐碱能力的研究鲜见报道,主要集中在芽孢杆菌、沙雷氏菌和肠杆菌等的研究,且多为先通过研究盐碱的抗性与溶磷、产吲哚乙酸(IAA)和ACC脱氨酶活性能力对菌株进行初步筛选,再与植物互作筛选可提高水稻耐盐碱能力的菌株,方法较为复杂,同时可能遗漏单独存在时无抗盐碱或产酶能力,但与植物互作时可提高双方耐盐碱能力的菌株。

杨美英等[16]研究发现可溶磷的沙雷氏菌和肠杆菌的加入可提高水稻根、茎、叶中渗透调节物质的增加,并能提高水稻产量;谢金宏[17]发现一株沙雷氏菌和一株巨大芽孢杆菌均可降解难溶磷,提高水稻在盐碱地中的生长能力;韩笑[18]研究发现一株肠杆菌的加入可通过增大溶磷量、产吲哚乙酸等方式提高水稻种子在盐碱胁迫下的发芽率和水稻幼苗的生长能力。而本研究采用的两步筛选法,首先使用平板初筛可高效便捷地筛选出能有效提高水稻耐盐碱能力的菌株,再进行培养瓶水培试验复筛,在更加符合水稻生长规律的培养条件下,进一步验证供试菌株对水稻耐盐碱能力提升的效果和稳定性,方法简便,值得推广使用。

本研究通过微生物刺激提高水稻耐盐碱能力具有经济高效、节约能源、效果稳定等优点,同时是对盐碱地资源的有效利用,且无污染,对环境友好型、资源节约型生态农业的发展具有重大意义[19-21]。耐盐碱水稻的研究提高中国粮食产量,是解决人民温饱问题最有力途径之一,对盐碱地资源的有效利用和在一定程度上解决人地矛盾也有较为重要的意义[22]。而S4菌株的加入明显提高了耐盐碱水稻在盐碱胁迫下的生长能力和产量。并且S4菌株可在盐含量4.0%时正常生长,能够耐受高达9.5的碱性p H,表明该菌株具有良好的商业应用潜力,对耐盐碱水稻的产业化发展和盐碱地资源的利用有较大作用。

S4菌株刺激水稻提高耐盐碱能力的具体作用物质及其机理尚不明确,为了进一步发挥S4菌株的潜力,需要进一步研究探讨其作用机理以及最佳施用条件。