宿半夏悬浮细胞培养及体细胞胚发生的研究

陶兴魁,张兴桃,冯 凡,王海潮

宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州,234000

半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥块茎，是一种重要的中药材。半夏野生资源分布于东北、华北以及长江流域等地区，主产于四川、湖北、江苏、安徽等省份，采挖季节为夏天和秋天茎叶茂盛时期。半夏主要功效有燥热化痰、降逆止呕、消痞散结，近些年研究发现还具有抗肿瘤、降血脂、保护肝脏等多种重要作用，据统计在500多种中药处方中，半夏使用频率高居第22位[1-2]。宿半夏生长在宿州、淮北等地，质量上等，根据清光绪年间《宿州志》中有记载：“宿半夏唯独四铺、孙町(现在淮北市境内)佳也，宿半夏粉足、色白，北京同仁堂点名要此地半夏”[3]。目前关于半夏组织培养方面的研究已有很多，但是关于半夏细胞悬浮培养过程、悬浮培养下单细胞诱导胚胎发生方面的研究报道较少。刘贵贤等[4]研究将半夏愈伤组织接种在MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA培养基中连续继代3次，得到的疏松愈伤组织适于建立半夏细胞悬浮培养体系。 李欢等[5]以半夏疏松愈伤组织为试验材料，采用细胞悬浮培养，通过控制培养条件(温度、咖啡因、蔗糖浓度)研究表明8 ℃处理12 h，恢复36 h，悬浮细胞同步化效果较好，分裂指数为13.86%。毛春娜等[6]研究结果显示低温处理可以明显影响半夏悬浮培养细胞的同步化，有效提高其分裂指数。陶兴魁等[7]对半夏试管块茎悬浮培养加以水杨酸刺激，研究了半夏体内生物碱的含量变化。近些年，通过植物生物技术高效获得体细胞胚，然后通过体细胞胚进行植株再生研究已成为热门方向[8-10]。文本在建立宿半夏悬浮培养体系的基础上，对宿半夏细胞悬浮培养的生长周期和生长周期中的pH、细胞干鲜重的变化、悬浮培养体细胞胚胎发生进行了研究，为宿半夏组织培养的开发和优良无性系的繁殖提供相关依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

宿半夏由安徽省淮北市濉溪县飞龙中药材科技开发研究所提供，经淮北师范大学生命科学学院薛建平教授鉴定为安徽道地药材宿半夏的新鲜块茎。

1.2 方 法

选取宿半夏块茎外植体，经体外消毒、接种、组织培养获得愈伤组织。20 d后，取3.5 g质地疏松、分散性好的愈伤组织，接种在添加2,4-D和6-BA的MS液体培养基中[11-12]，3%蔗糖，300 mg/L水解酪蛋白(CH)，pH 5.8～6.0，温度25±1 ℃，置于水平旋转式摇床上振荡培养，转速为90～100 rpm，光照条件下悬浮振荡培养。筛选最优的悬浮培养条件，得到宿半夏悬浮细胞系，用100目不锈钢筛对悬浮细胞进行过滤，保留滤液，然后补充新鲜培养液，15 d后作为起始培养液。每5 mL悬浮母液转入含有30 mL液体培养基中，15 d继代一次。

用血球计数板检测细胞数目，计算起始密度(1.0×105个/mL)，用中性红染液检测活细胞数目，每2 d取其悬浮液检测细胞密度，并绘制细胞生长曲线图。用精密酸度计检测其pH值变化，然后用离心机对悬浮液进行离心，转速为5 000 rpm，离心20 min，弃去上清液称其鲜重，在60 ℃的温度下烘干4 h后称其干重。将宿半夏悬浮细胞转接到液体培养基中，降低或停止振荡培养，诱导体细胞胚胎发生。定期显微观察拍照。试验重复3次，利用Excel 2010、SPSS 19.0软件进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 悬浮培养的培养基筛选

将半夏块茎外植体增殖所得的愈伤组织接种在添加2,4-D和6-BA的液体培养基中振荡培养后均可得到悬浮培养细胞，研究结果发现两种植物激素不同浓度的搭配使用得到的悬浮培养细胞的分散度、生长情况及细胞胚性等差别教大。由表1表明，液体培养基MS+1.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+300mg/L CH中振荡培养，观察得到的悬浮细胞，生长增殖最快，单细胞最多，分散度好，活细胞率最高，细胞系比较稳定。

表1 不同植物生长物质对宿半夏细胞悬浮培养的影响

2.2 悬浮培养细胞生长曲线及生长状态的变化

试验结果发现，宿半夏悬浮细胞生长曲线呈“S”型(图1)，可分为延迟期(0～5 d)、对数生长期(6～14 d)、平稳期(15～19 d)和衰亡期(20 d后)。当细胞悬浮培养至衰亡期之前，活细胞数量逐渐增长至最大值，衰亡期后逐渐减少。因此，宿半夏悬浮细胞培养时间应控制在20 d以内，继代培养时间在15～18 d比较好。

图1 宿半夏悬浮细胞生长曲线

悬浮细胞继代培养2～3次后培养液中即有大量游离单细胞，多为椭圆形、月牙形细胞，圆形细胞较少(图2)，这时的细胞为非胚性细胞，表现为体积较大生长较慢。继代3～4次时，细胞形态发生变化，即圆形细胞和椭圆形细胞开始增多，此时的细胞多为胚性细胞，细胞质浓厚，分裂增殖旺盛，多为均等分裂，能够看到细胞核(图3)。试验发现，第一次悬浮培养的细胞的延迟期较长，7 d左右，启动分裂的缓慢，生长较慢。经过2～3次悬浮继代培养后，启动分裂时间缩短，分裂增殖加快，用100目不锈钢筛过滤，滤去大细胞团和组织碎片，可得到宿半夏单细胞悬浮系，继续培养并趋于稳定。

图2 宿半夏游离单细胞

图3 宿半夏胚性细胞

2.3 宿半夏细胞悬浮培养pH值的变化

由图4结果可见宿半夏悬浮细胞培养过程中pH值随着培养时间延长有着明显的变化，宿半夏悬浮细胞接种到液体培养基中，0～2 d内pH上升到最高值6.72；但2～4 d内pH有一个明显下降的过程，降到5.2左右；随后pH又继续回升，6～24 d后pH便逐渐下降，到25 d时，培养基中的pH最低只有4.2左右。

图4 宿半夏悬浮细胞培养过程中pH值变化

2.4 悬浮培养液内细胞鲜重和干重的变化

由图5和图6结果表明，悬浮液中细胞的鲜重和干重变化随细胞的生长周期变化而呈现一致的变化趋势。在延迟期培养物增重缓慢；在指数期培养物增重迅速；而到衰亡期增重几乎停止，甚至出现下降的趋势。因此，宿半夏悬浮细胞培养的最佳收获期为20 d左右。

图5 宿半夏悬浮细胞培养过程中鲜重的变化

图6 宿半夏悬浮细胞培养过程中干重的变化

2.5 宿半夏悬浮细胞体细胞胚的发生过程

将继代3～4次获得的宿半夏悬浮细胞转接到液体培养基MS+1.5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA+300 mg/L CH中降低或停止振荡培养。2 d后就开始有细胞分裂(图7)，6～8 d后可见到胚性细胞团块形成(图8)，14～16 d后可观察到有胚状体的形成，30 d后产生大量的胚状体，此时多数处在球形胚时期(图9)。40 d后球状胚颜色变成绿色，而且在胚状体上可以看到有芽点产生，此时胚状体迅速增殖变大，直径约为5～6 mm(图10)，胚生长状况良好，可进一步发育形成成熟的胚。

图7 悬浮细胞(2天)

图9 胚状体(30天 )

图10 胚状体(40天)

3 讨 论

关于体胚起源问题，大部分学者认为体胚起源于单个细胞，胚性单细胞先发生不均等分裂形成二细胞、四细胞、进而形成多细胞原胚，继而发育为具有胚芽和胚根的成熟胚。在植物体细胞胚诱导过程中，细胞分裂素和生长素起到关键作用，两者结合使用在很多植物体细胞胚诱导过程中起到很好的效果[13-14]。冯诚诚等[15]研究苦瓜未授粉子房的胚状体诱导，结果表明1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.04 mg/L TDZ培养基胚状体的诱导率最高为19.60%。罗成科等[16]研究表明，将半夏悬浮细胞接种于附加不同浓度2,4-D和6-BA组合的培养基中均可诱导出体细胞胚，当2,4-D浓度下降到1.0 mg/L时，可以产生大量的体细胞胚，说明低浓度的2,4-D有利于体细胞胚发生。孔凡芹等[17]用0.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA配比使用，楤木胚状体诱导和增殖的效果明显，胚状体分化率达50%以上，增殖倍数达11.337倍。建立高效的半夏悬浮细胞培养体系，研究半夏悬浮细胞胚状体的发生，是后续基于单细胞水平的半夏多倍体诱导获得再生植株(组培苗)以及半夏人工种子生产量产化的有效途径，优质半夏体细胞胚胎是进行半夏快速繁殖的重要材料[18-19]。目前，由于半夏野生资源的日渐匮乏，通过研发半夏人工种子能有效地解决半夏品种退化，种茎缺乏，病害侵袭，野生资源濒危等问题，且对提高半夏的产量和质量意义重大[20]。

本试验研究发现，宿半夏细胞悬浮系的细胞生长曲线呈现S型，与其他药用植物如黑果枸杞、太行菊的生长规律是一样的[21-22]。pH值呈先升高后下降，然后再升高，最后缓慢下降的趋势。宿半夏悬浮细胞的鲜重和干重的变化基本上和细胞生长曲线保持一致，在延迟期细胞对环境的适应需要时间过程，此时不能很好地吸收营养物质，悬浮细胞增重缓慢；在指数期悬浮细胞能够充分吸收营养物质而增重迅速；而到衰亡期由于培养液中营养耗尽以及有害物质的积累导致悬浮细胞增加几乎停止，甚至有下降的趋势。采用1.5 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L 6-BA配比使用，添加适量的蔗糖、水解酪蛋白，降低振荡速度后可诱导出了大量优质的宿半夏体细胞胚。体胚的诱导及发育不同时期对外源植物激素的需求是动态变化的，只有适时适量的调整植物激素，才能确保高频率诱导形成高质量的体细胞胚，在培养基中加入水解酪蛋白能明显促进体胚形成，适宜浓度为300 mg/L。

本研究通过宿半夏块茎诱导愈伤组织，对宿半夏愈伤组织进行液体振荡悬浮细胞培养，可以获得了大量球状体细胞胚，而且培养过程简单，成产效率高，体胚生长质量良好。为下一步宿半夏人工种子研究以及再生植株的获得提供新的方法，为宿半夏大规模细胞培养、试管苗的产业化生产以及次生代谢产物的研究奠定基础，对宿半夏药材的推广具有重大意义。