乳酸菌乙醇胁迫的应答机制研究进展

雍霖宣， 王晓丹， 舒伯精， 邱树毅， 班世栋*

1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州 贵阳 550025;2.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州 贵阳 550025;3.贵州庄稼汉薏米产业开发有限公司,贵州 黔西南州 561412

乳酸菌是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、无芽孢，并且能发酵多种糖类物质，终产物为乳酸的一类细菌总称[1]。具有促进人体健康和增加人体营养的功能，被认为是益生菌并用于食品工业[2]。乳酸菌具有一定的功能性，广泛应用于食品生产行业，目前有关乳酸菌发酵的食品种类多达120多种[3]。另外乳酸菌还被应用于医药与健康产业，作为益生菌有一定的临床应用效果[4-5]。在农牧水产和养殖业方面，也得到应用，乳酸菌发挥越来越大的作用于现代化农业生产[6-7]。在工业上通过乳酸菌代谢，可以获得高附加价值的产物[8-9]。乳酸菌具有多样性，根据有关研究报道，乳酸菌属于：厚壁菌门，包含4纲7目18科39属，包括653个种；放线菌门包含2纲2目3科12属，至少88个种[10]。所以乳酸菌种类繁多，且较为广泛地应用于我们的生产生活(图1)。

图1 乳酸菌在人类社会实践中的应用

乳酸菌作为食品中的发酵剂，扮演着重要角色，对产品风味和质地的形成及改善发挥着重要作用[11]。然而乳酸菌在食品发酵过程中会遇到对其生长不利的条件，比如乙醇胁迫，对乳酸菌的代谢活动和生产效率产生不利影响[12-13]。在传统中国白酒酿造过程中，窖池中乳酸菌发酵7 d后便成为优势细菌；随着发酵的进行，酵母代谢产生乙醇；在整个发酵体系中，环境的乙醇浓度逐渐增加，乳酸菌生长受到抑制，逐步衰亡[14-15]。但在发酵中后期，部分乳酸菌逐渐适应不利的环境，继而出现耐受较高乙醇浓度的乳酸菌，后续发酵过程产生乙酸、乳酸等代谢产物，对白酒的风味做出贡献。

面对外界环境胁迫，乳酸菌具有一定的适应机制，包括基因和蛋白质表达的变化[16-17]。乳酸菌种类繁多与人类生活息息相关，本文通过介绍乳酸菌受到乙醇胁迫后的表现，对细胞形态、膜组分、酶活性的变化以及代谢的影响，总结其乙醇耐受机理，旨在为更好的了解乳酸菌科学，加快乳酸菌在人类生产生活中的应用，为乳酸菌乙醇胁迫应答机制的研究和优良菌株的选育提供参考。

1 乙醇胁迫对乳酸菌的生理特征及代谢影响

1.1 对生理特征的影响

乳酸菌广泛运用于乳制品、果蔬制品、酒精饮料、面制品等发酵食品。在传统中国白酒酿造过程中，乳酸菌是重要的细菌，尤其是在白酒发酵中后期，乳酸菌由于其耐受较高乙醇浓度等恶劣生长环境，从而成为绝对优势细菌[18]。乳酸菌代谢生成乳酸和乙酸，是白酒风味的重要组成，对其他酿造微生物的生长产生影响，继而影响整个发酵过程，是白酒酿造过程中重要的功能微生物。

在食品生产加工过程中，乳酸菌不可避免的受到各种环境胁迫，对其生长产生不利影响。其中乙醇胁迫较为常见，乙醇对细菌的伤害一般归因于等离子体的干扰，破坏细胞膜完整性[19]。研究表明，5%体积分数的乙醇便能抑制乳酸菌的生长速度[20]。乙醇体积分数为8%～10%的条件下其生长会受到明显抑制[21]。12%体积分数以上的乙醇浓度不仅抑制细菌的生长，引发代谢异常，细胞膜褶皱和破裂，膜结构遭到破坏，严重影响了细胞膜功能性和通透性，甚至造成菌体的大量死亡[22]。乙醇会影响微生物细胞膜组成、结构和流动性[23]，其作为有机溶剂对乳酸杆菌的毒性主要表现在细胞膜的破坏上，乙醇渗透到细胞膜可以改变膜结构，破坏膜完整性，抑制膜功能，影响细菌代谢的关键酶活性，从而降低细菌存活率。

1.1.1细胞形态发生变化

当乳酸菌遭遇乙醇胁迫，随着乙醇浓度的增加，如图2所示，经过8%乙醇胁迫后(2 d)扫描电镜下可以发现细胞表面变得粗糙和折叠，甚至破裂导致内含物流出[24]。CHEN等人的研究表明，随着乙醇浓度增加到6%及以上，细胞形态变化较为明显，细胞破碎且外围变得模糊，细胞之间相互聚集并粘附在一起[25]。

图2 乙醇胁迫后乳酸菌细胞形态变化

较高浓度的乙醇胁迫会导致细胞膜组成成分受损，损害细胞膜完整性；对代谢产生负面影响，继而降低细胞的生存能力。KIM等人通过测量释放的O-硝基酚的荧光强度来确定乙醇对细胞膜的破坏能力[26]。其主要原理是，β-半乳糖酶是细菌的内源性酶，只有当细胞膜受损后才会释放到细胞外；β-半乳糖酶可分解形成O-硝基酚，其最大吸收峰值为420 nm，所以在420 nm的荧光分光光度计下测量可以得知乙醇对细胞膜的破坏程度[25]。

这些研究表明乳酸菌在面临一定浓度的乙醇胁迫后，细胞形态发生变化，细胞折叠甚至破碎。

1.1.2细胞膜组分发生变化

乳酸菌细胞壁主要成分是肽聚糖和磷壁酸以及少量的类脂体。这些含量不多的脂质成分，通常是不饱和脂肪酸，往往影响着细胞膜的流动性[27]。较长的脂肪酸链更容易穿过细胞膜,促进酰基链填充,并使膜环境更像凝胶状,通过减小游离酰基链末端的运动以降低膜的流动性和不稳定性[28]。膜流动性降低，使细胞对乙醇的渗透性降低，从而在一定程度上提高了对乙醇的耐受能力[29-30]。有关研究表明，从葡萄酒中分离出的乳酸菌，在不同发酵时期面临不同的乙醇浓度，可以自主调节膜脂质组成[31]。

DA SILVEIRA MG等人研究表明随着乙醇浓度增加，细胞中脂肪酸的不饱和程度也相应增加[32]。这与BONOMO MG等人的研究结果相一致即乳酸菌细胞膜的组成会受到乙醇胁迫的影响而发生变化，表现在细胞中不饱和脂肪酸的比例增加[33]。

乳酸菌面临乙醇胁迫发生的一系列连锁反应，改变了细胞膜物理和化学状态，即不饱和脂肪酸增加，膜流动性降低。

1.1.3酶的活性发生变化

酶在细胞生长代谢过程中发挥着重要作用，在传统中国白酒酿造过程中，来自于原料中不同的酶也发挥着不同的作用，对白酒的风格与品质都有一定的影响，某些酶对合成白酒中重要的香气成分，酯类物质做出了贡献[34-35]。而酶的本质是蛋白质，朱敏等人的研究表明，经不同体积分数的乙醇胁迫后，乳酸菌D5-5的乳酸脱氢酶活性明显低于胁迫之前，酶活性随着乙醇浓度的升高而降低，即乙醇胁迫对乳酸菌细胞中的酶活性具有抑制作用[36]。

CHEN等人通过测量β-半乳糖苷酶的相对酶活性研究了乙醇对膜渗透性的影响[37]。当细胞遭遇乙醇胁迫后，不同的酶会跟随乙醇浓度发生相应的变化，以适应外界环境的改变。

1.2 乙醇胁迫对乳酸菌代谢的影响

代谢组学可以揭示乙醇胁迫后细菌细胞内代谢物的变化，以阐明外部刺激对某种代谢途径的影响。有研究表明，乙醇胁迫导致参与柠檬酸代谢和细胞膜结构的基因表达[22]。此外乙醇胁迫还会抑制糖酵解和三羧酸循环[38]。

CHEN XQ等人通过研究乙醇胁迫对植物乳杆菌细胞内代谢的影响，共检测出55种主要代谢物，包括19种氨基酸、28种脂肪酸和8种糖；绘制PCA图可以观察到乙醇胁迫细胞和对照细胞之间的代谢差异，结果表明不同浓度乙醇下植物乳杆菌细胞内代谢物存在显著差异；PLS-DA模型与PCA模型聚类结果相似，即在一定的压力条件下，细胞内代谢物，氨基酸、脂肪酸和碳水化合物，会发生一定程度的变化; 这与WANG等人的研究结果也相一致[39-40]。

代谢组学分析表明，乙醇胁迫通过抑制三羧酸循环和糖酵解途径，导致代谢通路受到抑制，因此，乙醇对乳酸菌的抑制作用是通过破坏细胞膜功能，从而诱发细胞内代谢失衡来实现的。通过细胞内代谢物变化的研究，可以了解乙醇对乳酸菌代谢途径的影响，对于进一步认识乙醇对乳酸菌生长抑制机制具有重要意义。

2 乳酸菌耐受乙醇的机制

2.1 细胞膜调控

细胞膜是微生物抵御外部恶劣环境的第一道屏障，因此保持健康的膜生理功能有助于乳酸菌的生长和代谢[41]。当乳酸菌在发酵过程中遭遇乙醇胁迫，对细胞膜的结构和功能产生了干扰，不可避免的对乳酸菌生长代谢造成负面影响；为了应对乙醇胁迫，细胞发挥了一定策略来应对外部恶劣条件，如膜脂肪酸分布的变化、膜流动性和膜完整性的变化[42]。脂肪酸组成的变化主要表现在饱和程度、链长度、分支状或环状脂肪酸等方面，不饱和脂肪酸占比增多，碳链长度增加[43]。相关研究也表明，低浓度的乙醇胁迫可以提高共轭亚油酸合成相关酶基因的转录水平[44]。

细胞膜中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例变动被认为是乳酸菌抵御乙醇胁迫的重要机制，脂肪酸比例的变化会引起细胞膜流动性改变，在一定程度上会影响磷脂双分子层对外部质子、离子等其他物质的选择透过性；细胞膜的结构完整性遭到破坏其通透性因此降低，但是乳酸菌会根据外部环境及时调整膜结构与组分，使细胞在不利环境胁迫条件下维持正常生存[45]。

这些结果均表明，调节膜生理功能，包括膜脂肪酸的分布、流动性和完整性变化，是乳酸菌提高细胞在乙醇胁迫下存活率的重要保护机制之一。

2.2 热激蛋白的合成

起初热激蛋白的发现是在细胞受到高温条件刺激下的特定蛋白质，发挥着稳定细胞膜和蛋白质的作用，(如图3所示)也可参与蛋白质的装配与折叠过程[46]；后来研究发现在其他物理化学因素的刺激作用下比如说乙醇胁迫，也可以激活热激蛋白的表达[47]。常见的热激蛋白主要有分子伴侣蛋白、蛋白酶和DNA重组修复蛋白[48]。当细胞受到乙醇胁迫作用后会引发细胞内一些酶和功能性蛋白的降解，从而影响细胞的正常生长与新陈代谢，但乳酸菌可发生应激反应,产生热激蛋白从而提高细胞对乙醇的抗性。

图3 热激蛋白对蛋白质的正确装配作用

一方面细胞本身会合成热激蛋白，另一方面细胞在受到乙醇胁迫后也会产生，相关研究表明产生热激蛋白的乙醇浓度一般为4%，并且随着乙醇浓度的增加而增加[49]。热激蛋白中的分子伴侣蛋白，可以防止蛋白质的错误折叠与聚集，让受损肽链重新折叠，并将其转运至线粒体、内质网等细胞器发挥作用，从而降低乙醇造成的损伤[50]。

而和热激蛋白有关的基因Hsp31p和Hsp32p基因的表达可发挥蛋白酶的功能[51]，Hsp150基因可以影响细胞壁及其结构的改变[52]。ADU KT等人的研究表明，当乳酸菌受到环境胁迫后热激蛋白上调，在细胞的自我防护作用中发挥着一定作用[53]。

尽管热激蛋白在乳酸菌乙醇胁迫过程中提升细胞对乙醇的耐受性发挥着重要作用，但其诱导和调节机制尚不明朗仍需进一步探究。

2.3 氨基酸代谢调控

在乳酸菌细胞中氨基酸不仅发挥着营养物质的功能，还在蛋白质的装配与折叠过程扮演着重要角色。如表1所示, 不同氨基酸在乳酸菌面临环境胁迫后都发挥着重要作用。乳酸菌受到乙醇胁迫后，氨基酸可以在一定程度上调节细胞渗透压从而稳定细胞中生物大分子的结构形态，DNA 的Tm值降低，进而提高乳酸菌对乙醇胁迫的抗性[54]。精氨酸是乳酸菌中的一种氨基酸，可以通过8个酶促步骤从谷氨酸合成，并通过精氨酸脱亚氨酶途径(ADI途径)完全降解为鸟氨酸、氨和二氧化碳，此途径产生一个ATP分子并消耗两个质子，有助于乳酸菌细胞内部pH稳态，有关报道还表明ADI途径为细胞存活和对乙醇的耐受提供了能量[55]。此外， SETTACHAIMONGKON S等人分析了乳酸杆菌和双歧杆菌BB12在乙醇胁迫下的代谢物，结果显示代谢物变化最大的是氨基酸，这在一定程度上揭示了氨基酸的积累可能是细胞自我保护的重要机制[56]。

表1 环境胁迫下乳酸菌中氨基酸的生理功能

相关研究表明，乳酸菌中，精氨酸脱亚氨酶(ArcA)，鸟氨酸氨基甲酰基转移酶(ArcB)和氨基甲酸酯激酶(ArcC)的精氨酸代谢受到ArgR和AhrC的两个转录调节因子的调控[57]。这两个转录调节因子是精氨酸生物合成抑制所必需的，在氨基酸的存在下AhrC是激活精氨酸降解ADI途径所需的抗阻遏物[58]。DEZ L等人的研究表明在乙醇胁迫乳酸菌中，精氨酸降解的脱亚氨酶途径的基因(ADI途径)激活高达42.7倍，参与脂肪酸合成的基因(1.9倍激活)编码应激蛋白的基因：cspC和cspD(激活高达2.0倍)，然而不管是脂肪酸还是应激蛋白在乳酸菌抵御乙醇胁迫过程中都不同程度的做出了贡献，所以精氨酸在乳酸菌乙醇胁迫应答中同样也发挥着重要作用[59]。DI MARTINO C等人研究了乳酸菌在生长过程中添加外源性脯氨酸时，不同浓度乙醇胁迫情况下其存活率的差异，结果表明脯氨酸提高了乳酸菌的乙醇耐受性[60]。也印证了TAKAGI H等人的研究，脯氨酸可以保护细胞在一定程度上免受损伤，保持细胞膜的完整性，提升对乙醇胁迫的耐受性[61]。

细胞中氨基酸的增加有利于提高细菌对乙醇的耐受性[62]。这与TAKAGI H等人研究基本一致，谷氨酸和蛋白质在细胞中的积累可以保护微生物免受乙醇胁迫[63]。同理，添加外源氨基酸也增加了细菌的乙醇耐受性，这可能是由于氨基酸的加入可以使细胞膜结构更加稳定。通过上述细胞内氨基酸代谢的分析，可以得出结论，氨基酸代谢调控是乳酸菌在受到乙醇胁迫后的另一自我调控与保护机制。

2.4 乙醇耐受基因

某些基因的表达对细胞膜的成分合成具有一定贡献，而完整健康的细胞膜才能抵御乙醇胁迫，所以我们将这些与细胞抵御乙醇胁迫可能有关联的基因称之为乙醇耐受基因。如图4所示，乳酸菌通过上调某些基因的表达来构筑完整的细胞膜结构，以此提升菌体对乙醇胁迫的耐受性。当乳酸菌面临乙醇胁迫，与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸相关代谢基因(pyrB、dltA、dltB)在乙醇胁迫后显著上调表达；而这些氨基酸与细胞壁主要成分肽聚糖、磷壁酸的合成相关，由此可能通过提高这些基因表达构筑完整的细胞膜以此抵御乙醇对细胞的损害[68]。YANG XP等人探讨了acrR基因对从中国白酒发酵谷物中分离出的乳酸菌NF92乙醇的耐受性和适应性机制，通过基因敲除发现acrR可以积极调节脂肪酸生物合成，从而提高细胞的乙醇耐受性[69]。

图4 乳酸菌乙醇胁迫转录调控机制

生物信息学分析表明，Oenococcusoeni增强了肽聚糖的生物合成，并且改变了细胞膜脂肪酸组成，增加了recN和mutT基因的表达，从而最大程度地减少了DNA损伤[70]另有研究发现超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽浓度都有显著提升，这导致细胞内活性氧(ROS)积累的减少；此外puuE的异源表达表现出膜中两个ATPase活性的增强，从而保证了细胞膜的完整性；puuE基因通过减少ROS积累和增强细胞膜完整性，发挥着提高乙醇耐受性的作用[71]。GUO JF等人的研究结果表明pfK和gK对于提升乳酸菌的乙醇耐受性扮演者重要角色，并且可以提高乳酸乳球菌NZ9000的乙醇耐受性；同样pfK和gK均被认为是具有提高乙醇耐受性的基因[72]。

但是目前人们对于乙醇耐受性基因的相关研究和认识并不多，还需要科研工作者进一步探索。

3 结语

乳酸菌广泛参与食品的发酵过程，对食品的组分和风味都有一定的影响，研究乳酸菌在食品中发挥的作用，特别是在发酵食品中，乳酸菌面临乙醇胁迫后的变化及其机制，将有助于加深对乳酸菌特性的认识。

尽管国内外科研人员对乳酸菌乙醇胁迫的机制展开了研究，也取得了部分成果，但对乳酸菌乙醇胁迫后的影响及其变化不够深入，乳酸菌遭遇乙醇胁迫后，细胞中不饱和脂肪酸增加；热激蛋白的合成增加了其乙醇耐受性；某些氨基酸，如精氨酸和谷氨酸的积累，提高了细胞对逆境的抗性；同时也发现了部分乙醇耐受基因。目前研究主要从细胞膜调控、氨基酸代谢调控、热激蛋白的合成和乙醇耐受基因等其他方面展开研究。

然而在食品发酵过程中，乳酸菌乙醇胁迫面临的是一个复杂的环境，因此如果能够进一步认识乳酸菌在面临多种环境因素胁迫作用下的应答机制，以及在食品发酵过程中的代谢产物变化和对食品发酵的作用，都具有重要的理论研究价值，将对乳酸菌食品发酵具有重要指导意义。