婴幼儿配方食品中乳铁蛋白含量测定方法的研究

聂晓臻， 孙 洁， 王 倩， 俞方璐

中检科(上海)测试技术有限公司,上海 201206

乳铁蛋白是一种天然的、具有免疫功能的球状单体糖蛋白，属于转铁蛋白家族的一员。乳铁蛋白具有杀菌和抑菌、抗病毒、抗氧化、免疫调节、调整肠道菌群、促进铁吸收等功能[1]。婴幼儿配方食品成分复杂，其中脂肪、碳水化合物、蛋白质含量高，而乳铁蛋白含量低，常见乳粉添加量在20 mg/100 g～50 mg/100 g左右，在检测过程中，各种杂蛋白干扰大。目前，国家尚未制定检测婴幼儿配方食品中乳铁蛋白含量测定的标准方法。因乳铁蛋白未进入检测体系，年度食品安全监督抽检并未包含该项检测，将会影响业界对婴幼儿配方食品质量的判定，不利于婴幼儿配方食品中营养强化添加剂的风险监督监测。因此，我国急需对婴幼儿配方食品中乳铁蛋白的检测方法进行探究，完善我国食品安全管控体系。所以本研究从国家标准、行业标准等乳制品检测方法中选出5种蛋白质沉淀前处理过程，比较分离蛋白质后，乳铁蛋白的测定结果，为日常检测乳铁蛋白提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

乳铁蛋白标准品，Glycarbo；乙腈(色谱纯)，上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠、磷酸、十二水合磷酸氢二钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸(分析级)，上海凌峰化学试剂有限公司。

1.2 仪器

U3000高效液相色谱仪，配备紫外检测器(VWD)(美国赛默飞世尔科技有限公司)；HiTrap Heparin HP(1 mL)肝素亲和柱(美国GE Healthcare)；电子天平(赛多利斯)；超声清洗仪(昆山舒美)；涡旋混合器(大龙)；pH计(赛多利斯)。

1.3 溶液的配制

磷酸氢二钠溶液(0.5 mol/L)：称取17.9 g十二水合磷酸氢二钠，加适量水溶解，用磷酸调节pH至7.00±0.05，加水定容至1 L。

磷酸氢二钠(0.5 mol/L)-氯化钠溶液(1.0 mol/L)：称取17.9 g十二水合磷酸氢二钠，58.4 g氯化钠，加适量水溶解，用磷酸调节pH至7.00±0.05，加水定容至1 L。

亚铁氰化钾溶液：称取15.0 g亚铁氰化钾，用水溶解并定容至100 mL。

乙酸锌溶液：称取30.0 g乙酸锌，用水溶解并定容至100 mL。

盐酸溶液(1 mol/L)：吸取83 mL盐酸，于1 L烧杯中，加917 mL水，混匀。

氢氧化钠溶液(1 mol/L)：称取40 g氢氧化钠于1 L烧杯中，加水溶解并稀释至1 L，混匀。

三氯乙酸溶液(150 g/L)：称取15.0 g三氯乙酸，加水溶解并稀释至100 mL，混匀。

实验室用水为Milli-Q超纯水。

1.4 标准溶液的配制

乳铁蛋白标准储备液(1.0 mg/mL): 称量按证书提供的纯度(98%)，准确称取乳铁蛋白标准品10.20 mg，用超纯水溶解，定容至10 mL，置于4 ℃冰箱中保存。

乳铁蛋白标准工作溶液：分别准确吸取乳铁蛋白标准储备液，用磷酸氢二钠溶液逐级稀释成浓度为10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的标准曲线工作液。

1.5 样品处理方法

称取5 g样品于50 mL烧杯中，加入20 mL水，涡旋混匀后待处理。含淀粉类样品(如米粉、面条等)，再加入0.5 g淀粉酶，于37 ℃水浴锅中酶解30 min后取出，冷却备用。

1.5.1磷酸沉淀过程[2]

用磷酸调节pH至4.6±0.1，转移至50 mL容器瓶中，用水定容至刻度，混匀，静置30 min后滤纸过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤至液相色谱进样瓶中，上机测定。

1.5.2三氯乙酸沉淀过程[3]

将样品溶液转移至50 mL容器瓶中，用三氯乙酸溶液定容至50 mL，静置5 min后滤纸过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤至液相色谱进样瓶中，上机测定。

1.5.3乙腈沉淀过程[4]

将样品溶液转移至50 mL容器瓶中，用乙腈定容至50 mL，混匀后静置10 min，滤纸过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤至液相色谱进样瓶中，上机测定。

1.5.4沉淀剂沉淀过程[5]

加入1.0 mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀，再加入1.0 mL乙酸锌溶液，涡旋混匀，转移至50 mL容器瓶中用水定容至刻度，静置10 min，滤纸过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤至液相色谱进样瓶中，上机测定。

1.5.5等电点沉淀过程[6]

用1.0 mol/L盐酸溶液调节试样溶液的pH至1.7±0.1，静置2 min后，再用1.0 mol/L氢氧化钠溶液调节试样溶液的pH至4.5±0.1，置于水浴超声15 min，充分提取后转移至50 mL容量瓶中用水定容至刻度，混匀后滤纸过滤，滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤至液相色谱进样瓶中，上机测定。

1.6 液相色谱上机条件

色谱柱：HiTrap Heparin肝素亲和柱；柱温：30 ℃；进样量：50 μL；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；流动相A：磷酸氢二钠溶液；流动相B：磷酸氢二钠-氯化钠溶液。

2 结果与讨论

2.1 乳铁蛋白标准曲线

乳铁蛋白的线性变化范围为：10 μg/mL ～200 μg/mL，线性回归方程为Y=0.167 9X-1.063 4，相关系数0.999 5。见图1和图2。

图1 乳铁蛋白标准溶液色谱图

图2 乳铁蛋白标准曲线

2.2 不同沉淀方法的加标回收率比较

在厂家提供的空白乳基奶粉中添加3 mg/100 g、20 mg/100 g和50 mg/100 g的乳铁蛋白，用1.5中提到的5种方法进行加标回收试验，分别进行六平行试样，表1为不同沉淀方法的乳铁蛋白加标回收率数据比较，色谱图见图3～图7。

表1 不同沉淀方法的乳铁蛋白加标回收率数据比较

图3 磷酸沉淀法加标样品色谱图

图4 三氯乙酸沉淀法加标样品色谱图

图5 乙腈沉淀法加标样品色谱图

图6 沉淀剂沉淀法加标样品色谱图

图7 等电点沉淀法加标样品色谱图

磷酸调节pH沉淀法的加标回收率在95.7%～102%之间，三氯乙酸沉淀法、有机试剂(乙腈)沉淀法、沉淀剂(亚铁氰化钾乙酸锌)沉淀法结果均未检出。等电点沉淀法回收率结果偏低，因此选择磷酸沉淀法。

2.3 检出限与定量限

在空白样品中添加低浓度的乳铁蛋白标准溶液，通过对仪器信噪比进行分析，以信噪比约为3和10进行评定检出限和定量限。本方法中乳铁蛋白的方法检出限为1 mg/100 g，定量限为3 mg/100 g。

2.4 不同基质对乳铁蛋白检测的影响

在市售产品中挑选了豆基奶粉、部分蛋白水解配方食品和米粉，向其添加1 mg/100 g、20 mg/100 g和50 mg/100 g的乳铁蛋白，经过磷酸沉淀处理上机，做六次平行实验，表2为不同基质下乳铁蛋白加标回收率数据比较。

从加标回收率可以看出，该方法同时适用于豆基奶粉和米粉，但不适用于部分蛋白水解食品。

2.5 实际样品检测

随机抽取市面上常见的额外添加乳铁蛋白的婴幼儿配方乳粉，经过磷酸沉淀处理上机，检测结果见表3。

表2 不同基质下乳铁蛋白加标回收率数据比较

表3 乳铁蛋白测定结果表

检测结果表明，以上7种婴幼儿配方乳粉的乳铁蛋白标签值与实测值一致。

3 结论

本实验比较了5种分离蛋白质的方法对婴幼儿配方食品中乳铁蛋白的测定结果的影响，其中，磷酸调节pH沉淀法的加标回收率在85%～105%之间，精密度在10%以内，且准确度高、稳定性好，但不适用于特殊医学用途部分蛋白水解食品。三氯乙酸沉淀法、有机试剂(乙腈)沉淀法、沉淀剂(亚铁氰化钾乙酸锌)沉淀法结果均未检出。等电点沉淀法结果偏低，准确度低，不适用于婴幼儿配方食品中乳铁蛋白的检测。