富硒（茶）糖蛋白对抗心肌线粒体氧化疲劳机制研究

刘 芹

（安康学院 体育学院，陕西 安康 725000）

生命活动、体育运动、竞技运动和体力活动等都需要心脏提供能量和氧气，心脏工作的能量由线粒体供给。硒能够保护心肌细胞线粒体的结构完整[1-3]。茶多糖具有抗疲劳、抗氧化的功能，文献研究结果显示，鲜有学者研究硒与茶多糖维护心肌细胞正常功能的机制。富硒绿茶不仅含有微量元素硒，还含有茶糖蛋白、茶多酚等多种有机物。本文选用安康紫阳天然富硒绿茶，从中提取纯化富硒茶（糖）蛋白（Se-rich tea glycoprotein，STG），然后通过动物实验，研究STG对心肌细胞线粒体抗氧化能力和增强能量代谢能力的影响机制。

1 研究对象与方法

1.1 实验对象

实验对象为Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，共24只，体重200～230 g，饲养环境温度25±5℃，相对湿度42%～68%。大鼠与饲料购自西安交通大学医学院。

1.2 实验方法

1.2.1 塑造实验动物模型

适应环境喂养大鼠7天后，以速度15 m/min、5 min/d进行为期3天的训练，筛选适合跑台训练的大鼠。将实验大鼠随机分为3组：安静对照组（quiet control group）、运动对照组（exercise control group）、运动加STG组（Exercise plus-Se-rich tea glycoprotein group）（每组个数均为8只，即n=8）。

动物运动模型塑造为：每天训练前以15 m/min的速度做适应运动5min后正式训练，训练模型基于Bedford[x]模型结合实际略加调整，为期8 w。1～4 w：速度=15 m/min（坡度分别为0%，5%，5%，5%），运动强度VO2max分别为52，58，58ml·kg·min-1；5～8w：速度=27 m/min（坡度分别为5%，5%，10%，10%），运动强度VO2max分别为74，74，81 ml·kg·min-1。力竭判断指标为动物跟不上预定速度，大鼠臀部压在笼具后壁，后肢随转动皮带拖达30秒，毛刷驱赶无效[4-5]。表现为呼吸深急、幅度大，呈疲劳表现，俯卧位，低头，刺激后依然不能继续运动。

1.2.2 STG提取与给药方法

STG提取。（茶）叶为陕西省紫阳县富硒绿茶，STG的提取参照文献[6]241中的方法进行。STG中多糖含量为52.34%，蛋白质含量为3.67%，硒含量为2.34 μg/g。

给药方法。每次运动结束后，对运动加STG组大鼠进行STG灌胃，剂量为100 mg/kg/d[7]，安静对照组、运动对照组大鼠灌胃等体积的生理盐水，实验为期8周。

1.2.3 取材及样品制备

第8周最后1天，在运动对照组和运动加STG组大鼠力竭运动后记录力竭时间，对安静对照组、运动对照组和运动加STG组大鼠均用20%乌拉坦（0.5 ml/kg体重）腹腔麻醉后，迅速取心脏置于预冷的生理盐水中洗净血污，再用滤纸吸干后置于-20℃冰箱保存备用。

线粒体制备。按心肌/缓冲液1∶10的比例将心肌放入预冷的缓冲液中剪碎匀浆，将匀浆液离心（3000 r/min，10 min），弃去沉淀，上清液再次离心（10000 r/min，10 min），得沉淀，用缓冲液将所得沉淀洗两次，加入一定量缓冲液制备成线粒体悬液。

1.3 测试指标

1.3.1 大鼠体重

用TCS-2000A型电子秤于每周训练后测定大鼠体重。

1.3.2 细胞抗氧化指标

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶 （glutathione peroxide，GSH-Px）、丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）、过 氧 化 氢 （hydrogen peroxide，H2O2）。

1.3.3 线粒体功能指标

ATP 酶 （aenosine triphosphatease，ATPase）（Na+，K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase）、羟脂酰CoA脱氢酶（hydroxyacyl-CoA dehydroge‐nase，HCD）、琥珀酸脱氢酶（succinate dehydroge‐nase，SDH）、细胞色素氧化酶（cytochrome-oxydase，CCO）。

1.3.4 蛋白质定量

上述指标均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，严格按照说明书规定的方法进行操作[8]111。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0统计软件的One-way ANOVA功能进行数据处理，常规方法计算均值±标准差（±s），进行t检验，确定差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 实验过程中大鼠体重变化

体重数据直接反应大鼠对实验的适应情况以及实验对大鼠个体发育的影响。每周实验结束后的星期天测定大鼠体重，体重情况见图1。图1测试数据显示，实验期间三个组的大鼠骨骼、肌肉发育均良好，没有肥胖的个体。

图1 STG及跑台训练对实验大鼠体重的影响Figure1 Effect of STG and treadmill training on body weight of experimental rats

2.2 大鼠心肌细胞线粒体的抗氧化能力

8周有氧力竭疲劳训练后，检测STG影响大鼠心肌细胞线粒体的抗氧化能力，结果如表1所示。

表1 各组大鼠心肌线粒体抗氧化能力Table1 Antioxidant capacity of myocardial mitochondria of rats in each group

由表1可知，与安静组比较，运动组的SOD活性具有显著性差异，GSH-Px、CAT活性具有非常显著性差异；运动加STG组的SOD、GSH-Px、CAT活性具有显著性差异。与运动组相对比，运动加STG组的SOD、GSH-Px活性具有显著性差异，CAT活性具有非常显著性差异。提示运动对心肌线粒体GSH-Px、CAT活性的影响更大，GSH-Px的主要组成成分为硒半胱氨酸，可以反映大鼠体内硒水平高低。GSH-Px促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽（GSH）反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽（GSSG）[9]。运动加STG能够提高大鼠体内硒含量，从而提高GSH-Px活性，能够维护心肌细胞膜的结构以及功能的完整[10]。CAT在体内可催化H2O2转化为无毒无害的O2、H2O，不至于生成有害的OH-。

与安静组对照发现，运动组和运动加STG组的MDA、H2O2值具有非常显著性差异。与运动组对照发现，运动加STG组的MDA、H2O2值具有非常显著性差异。心脏是全身血液循环的能量来源，心脏对能量供应要求较高。在大强度耐力性运动过程中心脏细胞能量的供应主要由线粒体通过脂肪酸β-氧化来提供能量。不饱和脂肪酸发生过氧化反应在细胞内会产生自由基[8]113以及MDA，MDA具有细胞毒性。MDA含量较运动组降低也说明了STG增强了心脏线粒体抗氧化功能，降低了细胞内自由基生成，从而使细胞内脂质过氧化减少[11]。

2.3 STG对大鼠心肌线粒体ATPase活性的影响

STG对大鼠心肌线粒体Na+，K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的影响见表2。

表2 各组大鼠心肌ATPase活性Table 2 Myocardial ATPase activity of rats in each group

从表2可以看出，与安静组比较，运动对照组的心肌线粒体ATPase活性有非常显著性差异，这与运动中能量代谢有关系；运动加STG组的ATPase活性具有显著性差异。与运动对照组比较，运动加STG组的ATPase活性具有显著性差异。说明STG提高了运动过程中大鼠心肌线粒体的能量代谢酶活性，进而能够提高运动中心肌细胞的能量供应。

2.4 STG对线粒体氧化酶活性的影响

STG对线粒体氧化酶活性的影响结果见表3。

表3 各组大鼠心肌HCA、SDH、CCO 活性Table 3 myocardial HCA，SDH and CCO activities of rats in each group

从表3可以看出，与安静对照组相比，运动对照组的HCD、CCO，及运动加STG组的HCD、SDH、CCO均具有显著性差异。运动对照组SDH具有非常显著性差异。与运动对照组相比，运动加STG组的HCD、CCO具有显著性差异，SDH具有非常显著性差异。这应该是与三羧酸循环效率提高有关系。

2.5 实验大鼠运动能力提升对比

大强度训练至疲劳的时间反映出各组大鼠运动能力的水平，测试结果显示，运动对照组大鼠的运动力竭时间是94.33±12.65 min，运动加STG组大鼠的运动力竭时间是126.72±12.87 min，力竭延缓率为34.34%（P<0.01）。

3 讨论

3.1 STG 功能活性

本实验使用的STG是参照池爱平等人的提纯方法从安康紫阳富硒绿茶提取得到的。池爱平等人发现，STG的活性成分包括糖、结合蛋白和硒，并且为含硒蛋白多糖，研究结构特点发现富硒茶多糖本身有其特定的活性功能，但有待于进一步研究[6]243。而本研究提取的STG具有抗氧化功能，STG能够提高线粒体ATP酶的活性，增强大鼠心脏生物氧化酶的活性，提高能量代谢的效率，增强运动能力。

硒、绿茶和糖蛋白已经被广大学者证实具有抗氧化功能[12]，但是不同抗氧化剂对大鼠不同组织的抗氧化效果差别较大[13]。本研究结果显示，运动加STG组大鼠心肌的GSH-Px活性相较于安静组和单纯运动组都具有显著性差异，说明硒提高了GSHPx的活性；STG对此组心肌线粒体 HCD、CCO活性的提高与运动对照组大鼠（P<0.05）相比较为明显，提示 STG保护了线粒体内膜结构的完整。因此，本研究中，STG的活性既表现为金属离子硒的活性，也表现为蛋白多糖的活性。

其他研究表明，富硒绿茶含有的茶多糖成分的抗氧化活性明显优于普通绿茶[14]。本研究提取的STG为天然富硒茶叶所含的硒和糖蛋白。胡秋辉等通过研究天然富硒茶叶的吸收率发现大鼠对天然硒的吸收利用率为68.05%～70.40%，而Na2SeO3的吸收利用率为65%，故天然富硒茶优胜人工富硒茶叶。同时天然硒与人工硒提高GSH-Px活性具有显著性差异[15]。本研究显示，陕西省紫阳县天然富硒绿茶对大鼠心脏细胞线粒体的GSH-Px活性（p<0.05）影响相较于安静和运动组大鼠都具有显著性差异，细胞内MDA产生量非常显著性降低（p<0.01），天然硒的抗氧化功能比亚硒酸钠强[16]。

3.2 STG提高心脏细胞线粒体抗氧化能力机制

表1、2显示，安静大鼠的 SOD、GSH-Px、CAT活性都比单纯运动和运动加 STG组大鼠的活性高，提示运动过程中抗氧化酶活性降低，心脏细胞线粒体会产生一定的氧化损伤。运动加STG组大鼠体内 SOD、GSH-Px、CAT活性均优胜单纯运动组大鼠，提示在相同运动强度、运动时间下，STG能够提高心脏细胞线粒体抗氧化酶活性，降低心肌线粒体的氧化损伤。

线粒体工作的稳定性受其功能稳定性影响，而功能稳定性受其代谢影响。在氧化过程中有部分电子漏出，在细胞内生成活性氧（ROS）。ROS对线粒体产生过氧化损伤，STG则通过两个方面提高心脏细胞线粒体生物氧化能力，一是提高SOD、GSH-Px、CAT三种还原酶活性，从而提高线粒体的抗氧化能力，保证线粒体功能的稳定。二是降低氧化反应产物 MAD、H2O2的水平，减少线粒体膜通透性的变化，线粒体膜电位处于稳定状态，减少线粒体内的 cytochrome C被释放到胞质中，cy‐tochrome C可以激活胞质中的 caspase凋亡反应，诱导细胞凋亡[17]。从而降低线粒体和细胞损伤，提高心肌线粒体细胞有氧氧化能力。

3.3 STG 提高心脏线粒体能量代谢效率机制

心脏在生命活动中有着举足轻重的作用，线粒体是心脏能量供应过程中主要的能量来源，线粒体能量合成受多种因素影响，如呼吸链抑制、相关抗氧化酶活性下降和线粒体膜通透性（mPTP）增加等，使线粒体膜生物电电位降低及ATP产生障碍，引起胞内ATP水平下降。心脏能量来源主要为线粒体的有氧氧化过程，并且线粒体作为有氧氧化的场所大约消耗细胞85%～90%的氧[18]。

能量代谢受到氧化还原反应中漏出电子形成的ROS影响，线粒体是产生内源性ROS的主要场所[19]，也是ROS损伤的主要靶点，当细胞产生量超出机体对其清除能力时，细胞线粒体发生损伤。主要表现为线粒体膜磷脂被氧化及电子传递链被破坏，从而影响 cytochrome C氧化酶和ATP合成酶活性，实验研究表明，STG对提高大鼠 ATP酶活性有显著性差异[20]。STG通过增强氧化还原酶活性来增强线粒体在能量代谢中的工作效率。

综上，STG增强心脏细胞线粒体能量供应效率的机制为：首先是提高心脏线粒体抗氧化的能力，从而增强心脏细胞的正常工作能力；其次是提高线粒体ATP酶和脂肪酸β-氧化酶和线粒体氧化酶的活性，加快物质代谢从而提高能量代谢效率。STG提高大鼠心肌细胞线粒体内ATP酶活性，进而提高心肌细胞线粒体能量代谢效率。SDH是唯一嵌入到线粒体内膜的酶，STG增强SDH活性的同时也保护了线粒体内膜的完整。其他研究也表明，线粒体膜、细胞核膜在低硒时会发生磷脂过氧化损伤，会产生心脏细胞线粒体伤害[21]，这也进一步说明硒具有保护线粒体膜、细胞核膜的功能。

4 结论

STG通过提高心脏细胞线粒体抗氧化酶活性，降低细胞氧化副产物来提高心脏抗氧化能力，机制与STG保护心脏细胞线粒体构造以及功能完整性有关系。因此，STG具有增强心肌细胞线粒体抗氧化能力及提高能量代谢标志酶活性的功能。