蜜蜂舞蹈行为研究进展

封王江, 张曌楠, 黄景南, 苏松坤

(1.福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)，福建 福州 350002；2.图卢兹第三大学生物与进化多样性实验室，法国 图卢兹 31062)

蜜蜂是真社会性的模式动物，更是重要的授粉昆虫[1-2].在膜翅目昆虫中，蜜蜂由于其独一无二的舞蹈行为而备受研究者关注.蜜蜂舞蹈行为与食物源、蜂巢选址和蜂群状态等信息传递密切相关[3-5].虽然蜜蜂可以通过跳舞传递新巢穴的位置信息或巢内情况，但是这样的舞蹈行为较少发生或较难被观察到.本文重点综述传递食物源信息的舞蹈行为，借助特制的蜜蜂观察箱，研究人员能够重复观察这种传递食物源信息的舞蹈行为.蜜蜂舞蹈行为是确保蜂群高效、高质采集食物的重要方式，能够保证蜜蜂个体和整个蜂群的生存与延续.有关蜜蜂舞蹈行为的出现时间，至今仍没有定论.结合大蜜蜂(Apisdorsata)、小蜜蜂(A.florea)、西方蜜蜂(A.mellifera)、东方蜜蜂(A.cerana)和无刺蜂(Melipona)等蜂种舞蹈行为的研究和目前已经寻找到的蜜蜂化石，研究人员发现蜜蜂舞蹈行为出现的时间可能早于蜜蜂属的起源时间[6].1967年，Von Frisch[7]较为详细地阐释了蜜蜂舞蹈行为所传递的信息，最突出的成果是破译了蜜蜂舞蹈行为所指示的食物源方向和距离信息.有人提出食物源信息是通过气味传递的[8].然而，该猜想很难解释在不同距离和方向存在相同气味食物的情况下，伴随蜂如何精确定位跳舞蜂所指示的食物源位置.借助摄像机、机械蜜蜂、微型雷达跟踪系统等设备和技术，研究人员再次证实了Von Frisch的发现，即蜜蜂是通过舞蹈行为传递食物源信息的[9-10].

蜜蜂舞蹈行为是否发生以及如何发展受到诸多因素的影响，不仅有外部环境的影响，还有蜜蜂个体和蜂群相互作用的影响.其中，蜜蜂对食物源收益性(food source profitability)的评估主要是指蜜蜂对食物相对价值的评估，是影响蜜蜂舞蹈行为发生以及跳舞“活泼”程度的重要因素[11].目前，大多数研究蜜蜂舞蹈行为的试验均使用糖水吸引蜜蜂采集，而后在蜜蜂观察箱处观察并记录蜜蜂的跳舞情况，在此过程中需要尽可能地控制其他变量对蜜蜂的影响.蜜蜂舞蹈行为的行为学主要关注的是蜜蜂舞蹈的外在行为表现所代表的含义；蜜蜂舞蹈行为的神经生物学主要关注的是与蜜蜂舞蹈有关的脑部神经系统和神经递质的变化；蜜蜂舞蹈行为的神经组学则主要关注与蜜蜂舞蹈有关的DNA、RNA和蛋白质等的变化.本文从行为学、神经生物学和神经组学层面综述蜜蜂舞蹈行为的发生和发展机制，为深入研究蜜蜂舞蹈行为提供依据.

1 蜜蜂舞蹈行为表现

蜜蜂舞蹈行为，也被称作蜜蜂“舞蹈语言”或舞蹈通讯，是其特有的一种符号交流方式，主要起到传递食物源信息的作用[5].从行为学角度来看，蜜蜂舞蹈是跳舞蜂将飞行和采集过程的信息整合并转化为舞蹈的一种行为，伴随蜂根据舞蹈行为解码食物源信息.蜜蜂传递食物源信息时的舞蹈行为表现主要有圆舞(round dance)和摆尾舞(waggle dance)(图1)[12]，这两种舞蹈形式主要见于西方蜜蜂和东方蜜蜂[7].圆舞是采集蜂返巢后的表现形式之一，其会在巢脾上一会儿向左转圈，一会儿向右转圈，交替进行.圆舞传递的信息是食物源在蜂巢周围50 m以内的位置，该行为不能准确传递食物源的距离和方向信息[13].当食物源的距离超过100 m时，蜜蜂会跳摆尾舞，即采集蜂会在巢脾上先往一个方向跑出一条直线并伴有摆尾动作，然后往某一个方向跑出一个半圆回到起始位置，之后沿着刚刚的直线继续摆尾前行，然后往另一个方向跑出一个半圆回到起始位置，从而形成一个类似于“8”字的轨迹，之后会重复这一系列动作直到舞蹈结束[14].摆尾舞不仅可以传递食物源的距离和方向，还可以传递食物源的气味和收益性[15-16].食物源的距离是通过一定时间内摆尾阶段的摆尾次数表示的；食物源的方向则表示为垂直的巢脾上摆尾阶段的摆尾前进方向与重力线的夹角，这是相对于食物源方向与太阳方向的夹角；食物源的气味是通过跳舞时蜜蜂之间的触角接触传递的[17]；食物源的收益性则是通过摆尾阶段的摆尾频率表示的，即食物越丰富，摆尾频率越高[18].

图1 蜜蜂的圆舞和摆尾舞[12]Fig.1 Round dance and waggle dance of honey bee

目前，关于食物源距离、方向和质量等信息在蜜蜂舞蹈行为中是如何以符号表征(symbolic representation)的，已经有很多研究，但是，蜜蜂舞蹈行为是如何产生的，这个问题仍未明确.食物刺激(food stimuli)与行为反应(behavioral responses)的关系早已得到证明[19].在自然环境或试验条件下，蜜蜂采集返巢后主要根据食物源的收益性等信息决定是否跳舞.在圆舞中，食物源收益性与舞蹈持续时间、转圈数和转圈速度呈正相关[20]；在摆尾舞中，摆尾阶段的持续时间和速度也随着食物源收益性的增加而增加[18,21].一段时间的采集经历会影响蜜蜂对食物相对质量的评估，进而调控蜜蜂舞蹈行为的发生[22].如在持续的采集过程中，面对突如其来的变化，蜜蜂会根据过往的采集经验判断是否继续跳舞招募同伴前往食物地点，这种机制能够确保整个蜂群的安全、高效采集[23].因此，在一定时间内，人为改变糖水浓度，或许可以连续调控蜜蜂的舞蹈行为.

2 影响蜜蜂舞蹈行为的因素

以蜂巢为界，蜜蜂的舞蹈行为主要受到外部环境和内部环境的影响.

2.1 外部环境因素

(1)食物的数量和质量.当外界蜜粉源稀疏分散时，采集蜂返巢后跳舞的概率较低[24].蜜粉源的质量会影响蜜蜂是否跳舞以及跳舞的积极性，质量因素包括花蜜的浓度和甜度、花粉的颗粒大小和黏度以及采集难易程度等[21,25-26].如高浓度的花蜜会增加蜜蜂的采集次数和采集量，使得采集蜂通过跳舞招募同伴前往食物地点，且跳舞持续时间更久、舞蹈活动更剧烈[18].(2)食物的距离.通常情况下，蜜蜂更倾向于采集距离蜂巢较近的食物[27].当食物源与蜂巢的距离不同时，蜜蜂会通过不同的舞蹈形式指示食物的位置.(3)捕食者的风险.蜜蜂的捕食者较多，如胡蜂、蟾蜍和熊等，它们会取食蜜蜂或蜂蜜，严重时毁坏整个蜂群[28].蜜蜂在采集过程中一旦遭遇捕食者，就会舍弃食物地点,更不会发生跳舞行为[21].(4)天气的变化.在外出采集食物的过程中，蜜蜂需要借助太阳、偏振光、重力、磁场和地标等定位食物源[29-31].恶劣天气会影响蜜蜂外出采集时的食物源定位，同时伴有无法返巢的风险，进而降低蜜蜂采集和跳舞的概率[32].(5)农药的使用.农药的广泛使用不仅会损伤蜜蜂的神经系统，还会极大地增加蜜蜂的死亡率.与采集正常糖水的跳舞蜂相比，采集含有亚致死剂量溴氰菊酯(deltamethrin)的糖水后,跳舞蜂舞蹈行为中每15秒内的转圈数、舞蹈的夹角度数和转身速度显著增加[33],说明溴氰菊酯会影响跳舞蜂对食物源信息传递的准确性.

2.2 内部环境因素

(1)巢内食物贮存量.在巢内空间有限的情况下，蜜蜂需要平衡产卵和食物存储的需要，当巢内食物充足时，巢内蜜蜂更愿意接受高质量的食物，进而影响采集蜂的采集和跳舞行为[34].(2)蜂群群势.正常蜂群内采集蜂占整个蜂群蜜蜂数量的5%～35%[35].强群里面采集蜂数量更多，意味着找到高质量食物源的概率更大，跳舞蜂数量和跳舞的次数也更多.(3)蜜蜂采集返巢后的伴随情况.蜜蜂在跳舞时，伴随蜂会分布在跳舞蜂周围，用触角与跳舞蜂接触，同时伴有交哺行为，即蜜蜂之间通过口对口交换食物.伴随蜂数量越多，接收食物的速度越快，反映了伴随蜂倾向于接收这种食物，进而促使蜜蜂采集和跳舞次数增加[36].(4)巢内病虫害情况.蜜蜂巢内病虫害主要有真菌病、细菌病、病毒病和寄生虫害等[37].当蜂群内部病虫害严重时，蜜蜂会减少外出采集和跳舞次数，甚至弃巢飞逃，寻找新的巢穴[38].

3 蜜蜂舞蹈行为的神经生物学研究

蜜蜂触角、复眼和单眼等分别接收不同的外界刺激信息，蘑菇体(mushroom bodies)负责输入信息的整合[39]；同时，脑部神经递质参与介导信息的传递，从而调控蜜蜂舞蹈行为[40].蜜蜂脑部活动与舞蹈行为有着密不可分的关系，从神经生物学的角度探究与舞蹈行为有关的神经系统和神经递质，有助于进一步理解蜜蜂舞蹈行为的发生和发展机制.

3.1 脑神经在蜜蜂舞蹈行为中的作用

蜜蜂舞蹈行为是诸多感官输入信息经加工和整合后呈现的结果，在漫长的进化过程中，蜜蜂感觉器官和神经系统不断适应外部环境的变化，并调节蜜蜂的行为.其中，蜜蜂脑起着传递、加工和整合外界刺激信息的作用.蜜蜂脑主要由蘑菇体、中央体(central bodies)、视叶(optic lobes)和触角叶(antennal lobes)等部分组成[41-42].蘑菇体是蜜蜂脑的重要组成部分，主要负责加工和整合多个感官输入的感觉信息，如嗅觉、味觉、听觉和视觉等信息，与蜜蜂的学习和记忆活动有关[43].喙伸反应(proboscis extension response, PER)是检验蜜蜂气味学习和记忆的重要方式，试验证明蜜蜂能够在较短时间内(约200 ms)辨别已习得的气味[44].一方面,蜜蜂脑部存在快速的气味信息处理系统;另一方面,蜜蜂具有高超的气味学习和记忆能力，使得蜜蜂能够准确地传递食物源的信息.中央体主要参与食物源的方向定位，与空间定向和飞行导航有关[45].蜜蜂视叶外连1对复眼和3只单眼，视叶主要负责传递复眼接收到的外部视觉信息，如太阳的方位、光流、偏振光和地标等，其中，复眼背部边缘区域能够感知偏振光，而单眼主要感受光强[46-47].触角叶主要接收来自于触角上的嗅觉神经元传递的气味信息[48]，触角还参与感知由腹部摆动和翅膀振动产生的方向和距离信息[49].

3.2 神经递质在蜜蜂舞蹈行为中的作用

神经递质是具有信号传递功能的化学物质，主要包括胆碱类、氨基酸类、神经肽(neuropeptide)类和单胺类等，在刺激和行为反应中起着介导信号的作用[50].乙酰胆碱是昆虫中枢神经系统中的一种重要的兴奋性神经递质[51].吡虫啉(imidacloprid)是一种烟碱类乙酰胆碱受体激动剂，可以介导胆碱能突触的信号传递，会对蜜蜂的嗅觉学习和记忆造成损害[52].使用亚致死剂量的吡虫啉会影响蜜蜂对蔗糖的反应和减少蜜蜂返巢后的摆尾舞次数[53].

目前，在蜜蜂中研究较多的氨基酸类神经递质主要为谷氨酸和γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA),它们分别为兴奋性和抑制性神经递质，与蜜蜂的嗅觉学习和记忆有关[54-55].研究还发现,谷氨酸门控氯离子通道(glutamate-gated chloride channels, GluCls)会介导蜜蜂脑部的抑制性电流[56].谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的催化作用下可以生成GABA[57].这两种氨基酸类神经递质在蜜蜂舞蹈行为中发挥的作用尚不可知，所以有必要检测跳舞蜂与非跳舞蜂脑部谷氨酸和GABA表达水平的差异.

神经肽通过作用于G蛋白偶联受体影响神经元活动,继而影响个体的生理变化和行为反应[58].神经肽与蜜蜂工蜂的社会行为调节、王浆分泌和采集行为有关[59].目前，针对蜜蜂舞蹈行为的神经肽研究缺乏，通过定量多肽组学、质谱、同位素标记等分子手段，比较研究跳舞蜂与非跳舞蜂的脑部神经肽差异表达情况，可能会发现某些参与调控舞蹈行为的特有神经肽.

生物胺在昆虫脑中可以起到神经递质、神经调质和神经激素的作用[40,60].研究表明，章鱼胺与蜜蜂的舞蹈行为有关，使用章鱼胺受体拮抗剂米安色林(mianserin)对跳舞蜂进行处理，发现其会影响跳舞蜂的舞蹈活力和转圈数，这两个因素与食物源的相对价值有关，即章鱼胺会影响跳舞蜂对食物源相对价值的传递[61].研究表明，章鱼胺与昆虫的奖励性学习有关，多巴胺与昆虫的惩罚性学习有关[62].这与“多巴胺与哺乳动物的奖励性学习和记忆有关”的报道[63-64]形成了明显差异.对黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的研究表明，蘑菇体中的多巴胺能信号也参与奖励性学习过程[65-67].通过高灵敏度的放射酶技术和高效液相色谱技术已经证实蜜蜂脑部多巴胺水平高于章鱼胺[68].多巴胺是动物中枢神经系统中重要的神经递质，与蜜蜂的学习、记忆和觅食有关.目前，多巴胺受体基因Amdop1、Amdop2、Amdop3和多巴胺转运体基因Amdat已在蜜蜂脑中被发现[69-72].通过检测跳摆尾舞的蜜蜂、伴随蜂、静息蜂脑部的多巴胺水平发现：跳摆尾舞的蜜蜂脑部多巴胺和多巴胺代谢产物N-β-丙酰多巴胺(N-β-alanyldopamine, NBAD)水平显著高于伴随蜂；而在给蜂群喂食多巴胺前体物质二羟基苯丙氨酸(dihydroxy-phenylalanine, DOPA)后，跳舞蜂的数量增加[73].由此可见，蜜蜂脑部多巴胺的增加可能可以驱动舞蹈行为的发生.然而，上述试验的取样方法存在不足，实验人员使用抽吸装置从蜂巢表面吸取蜜蜂，之后用二氧化碳对其进行短暂的麻醉，这些操作极有可能使得蜜蜂脑部多巴胺含量发生变化.用镊子将蜜蜂快速抓入液氮中冻毙的方法更有利于结果的准确性.此外，生物胺的激动剂和拮抗剂可以通过饲喂法、点滴法和注射法等多种途径进入跳舞蜂体内，以此观察跳舞蜂的舞蹈行为以及体内生物胺的变化情况[74].在昆虫体内，酪氨酸经酪氨酸脱羧酶催化产生酪胺，酪胺又经酪胺-β-羟化酶催化生成章鱼胺；而酪氨酸在酪氨酸羟化酶的作用下会生成左旋多巴，左旋多巴经多巴脱羧酶作用产生多巴胺[75].因此，在研究与蜜蜂舞蹈行为有关的神经递质时有必要检测跳舞蜂脑部的酪氨酸含量.除了章鱼胺和多巴胺以外，其他的生物胺也可能会参与调控蜜蜂的舞蹈行为，未来需要加强对跳舞蜂脑部其他生物胺的检测与分析.

综上所述，蜜蜂脑部有多种神经递质参与调控其舞蹈行为.化学连接组(chemoconnectome)是指动物化学传递中的全部神经递质、神经调质、神经肽及其受体；化学连接组学已经被应用于果蝇的研究，该方法可以系统研究认知和行为基础上的化学传递介导的神经信号通路[76].舞蹈行为的发生是神经回路或环路里多种神经化学物质介导神经信号产生的结果，借助化学连接组学方法以及基因编辑技术，可以更加全面地解析蜜蜂舞蹈行为的潜在神经调控机制.

4 蜜蜂舞蹈行为的神经组学研究

食物刺激的作用伴随着相应的行为表现和脑部神经系统的变化，同时，脑部的某些DNA、RNA和蛋白质等也会随之发生变化.不同行为状态下蜜蜂脑部的基因、mRNA和非编码RNA(ncRNA)是存在差异表达的[77-78].2006年，西方蜜蜂全基因组测序完成，这为在基因水平上研究蜜蜂舞蹈行为提供了途径[79].目前，有关蜜蜂舞蹈行为的组学研究主要集中在基因组学和转录组学方面[59].基因组学研究主要是对跳舞蜂进行全基因组测序与分析，从而找到参与调控蜜蜂舞蹈行为的候选基因.转录组学研究则是从RNA水平上检测与蜜蜂舞蹈行为相关的基因表达情况.神经组学是使用测序技术从组学的角度探究特定行为状态下与神经系统有关的DNA、RNA和蛋白质等的变化情况[59].因此，通过神经组学研究可以更加深入地了解调控蜜蜂舞蹈行为的分子机制，从而进一步剖析其舞蹈行为发生和发展的机理.

微阵列分析表明，表现出振动信号行为的蜜蜂和未表现出振动信号行为的蜜蜂的脑部基因表达模式存在较大差异，该研究证实了蜜蜂中与通讯信号相关的神经基因组脑状态[80].振动信号通讯(vibration signal communication)表现为一只蜜蜂用前足抓住另一只蜜蜂，然后以一种特有的行为方式使其身体背腹快速振动1～2 s，此类通讯方式可以促使信号接收者增加不同的行为活动，如采集、哺育、分蜂等[81-82].但是，该行为表现与蜜蜂舞蹈行为不同，蜜蜂舞蹈行为具有独特性和复杂性，更具备信息传递或交流的特质.比较跳舞蜂和非跳舞蜂的脑部神经基因组，有可能找到与蜜蜂舞蹈行为相关的候选基因.

蜜蜂属(Apis)中不同蜜蜂的“舞蹈语言”存在“方言”现象，即蜜蜂属中的不同种跳舞蜂展现食物源方向和距离信息的行为存在差异[83-84].例如：西方蜜蜂、东方蜜蜂和大蜜蜂都是在垂直的巢脾上跳舞，以重力线作为确定食物源方向的参考；小蜜蜂是在开放的水平巢脾上跳舞，无重力线作为参考且无声音线索[85-86].本课题组前期研究发现，中华蜜蜂(A.cerana)伴随蜂能够解码意大利蜜蜂(A.melliferaligustica)跳舞蜂的舞蹈行为并成功定位其所指示的食物地点[87].蜜蜂舞蹈行为上的差异可能会体现在脑部基因表达上.Moushumi et al[88]对西方蜜蜂、大蜜蜂和小蜜蜂的跳舞蜂的中枢神经系统的蘑菇体、视叶、中央体和第二胸神经节进行了转录组测序分析，结果发现，3种蜜蜂跳舞蜂的蘑菇体中的基因表达谱显示出最大的差异，而中央体和第二胸神经节的基因表达谱展现出相似性，并且许多基因的表达与新陈代谢和能量生成有关.该研究说明不同蜂种之间特有基因表达的差异可能反映了其舞蹈行为的差异.但是，该研究并未找到真正参与调控舞蹈行为发生和发展的基因，以后可以通过神经转录组学研究这个问题.

本课题组利用Solexa测序技术研究了西方蜜蜂采集蜂和跳舞蜂的microRNA及其表达图谱的差异，结果发现部分microRNAs的表达在采集蜂和跳舞蜂之间存在显著差异，表明某些microRNAs，如ame-miR-278和ame-miR-282，可能通过影响相关基因的表达调控蜜蜂的舞蹈行为[89].该研究不仅找到了部分可能参与调控蜜蜂舞蹈行为的microRNAs，还为研究者从非编码RNA的角度解读蜜蜂舞蹈行为提供了思路；但是，该研究将蜜蜂头部用于测序分析，蜜蜂头部不仅包括脑、王浆腺、唾液腺，还包括复眼色素、几丁质外壳和刚毛等，导致无法精确找到脑中与蜜蜂舞蹈行为有关的microRNAs.

以上关于蜜蜂舞蹈行为的神经组学研究主要集中在基因、mRNA和microRNA方面，尚无有关长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)调控蜜蜂舞蹈行为的报道.lncRNA一般指不具有蛋白编码能力、转录本长度超过200 nt的RNA，在转录和转录后阶段参与基因表达的调控，其生物学功能具有多样性，能够与DNA、RNA和蛋白质互作发挥功能[90].除了通过信号(signals)、诱饵(decoys)、向导(guides)或支架(scaffolds)等方式调控目标基因的表达外，lncRNA还可以通过反义(antisense)、顺式(cis)或反式(trans)机制与目标基因进行交互作用，从而影响目标基因的表达[91].lncRNA的表达还具有组织特异性和时空特异性，其在不同组织中的表达量是不同的，且在同一组织处于不同状态时表达量也不同[92].相比于非跳舞蜂，跳舞蜂经历了一个较为剧烈的反应过程，因此两者脑部某些lncRNA可能存在差异表达.目前，昆虫中已有大量的lncRNAs被发现和研究[93].研究表明，lncRNA-yar与果蝇睡眠行为有关[94]，lncRNA-CRG与果蝇运动行为有关[95]，lncRNA-Sphinx与果蝇求偶行为有关[96].学者们在蜜蜂中也发现了一些lncRNAs:Nb-1与蜜蜂工蜂的劳动分工有关[97]；Ks-1可能与蜜蜂脑部神经功能的调控有关[98]；AncR-1在蜜蜂脑、生殖器官和咽下腺等组织中都有表达，说明其参与调节多个组织的活动[99]；Kakusei与蜜蜂的采集行为有关[100].Liu et al[101]通过RNA测序技术探究了lncRNAs在蜜蜂从哺育蜂到采集蜂行为转变中的作用.因此，比较分析跳舞蜂和非跳舞蜂脑部的lncRNA表达图谱，再通过lncRNA与mRNA的关联分析，能够找到可能参与调控蜜蜂舞蹈行为的lncRNAs.此外，竞争性内源RNA (competitive endogenous RNA, ceRNA)假说提出，mRNAs、lncRNAs、假基因(pseudogenes)和环状RNAs(circular RNAs, circRNAs)可以通过microRNA响应元件(microRNA response element, MREs)竞争性地结合microRNA，揭示了RNA相互作用的一种机制[102].将来，通过ceRNA分析能够从非编码RNA的角度更加全面地解析蜜蜂舞蹈行为的分子机制.

5 总结

蜜蜂舞蹈行为是一种极其复杂且具有研究意义的通讯方式.在跳舞行为发生之前，跳舞蜂需要整合多方面的信息，不仅包括飞行过程中输入的信息(如光流、地标和太阳的方位)和取食过程中的食物源收益性和风险评估(如食物的质量、距离和是否有捕食者等)，还有返巢后伴随蜂的反应(如伴随蜂的数量、接收食物的积极性和速度等).蜜蜂舞蹈行为的表现已被很好地解读，然而，控制舞蹈行为的“开关”仍不清楚.虽然已知部分神经递质在舞蹈行为中发挥作用，但是具体的作用机制尚不明晰；与舞蹈行为相关的DNA、RNA和蛋白质是如何影响舞蹈行为的，目前所掌握的相关信息也较少.在未来的研究中，不论是仪器的更广泛应用，如共聚焦显微镜、液相色谱-质谱联用仪、核磁共振成像仪等，还是技术的更大突破，如基因编辑、测序和神经生物学技术等，都有助于进一步揭示蜜蜂舞蹈行为发生和发展的分子和神经机制，并能够为研究动物通讯提供新的思路.