环肽的结构多样性及药理作用

董家潇 宋亚红 李修政 严佳栋

几十年来，肽一直是生物化学领域一个重要而多样的研究方向。自然界中发现的大多数肽都以三维构象折叠形式存在，特定的三维结构为肽提供了独特的活性和选择性。随着研究的不断深入，科研人员发现了越来越多的独特肽，其中游离的N和C末端与形成环状骨架的常规肽键相连，普遍称为“环状”肽。环肽是自然界中最重要的生物分子之一，与传统的直线肽相比具有更高的细胞渗透性和更好的生物学活性[1,2]，其具有的有限构象柔韧性极大地增加了它们的代谢稳定性，并提高了它们对靶标的结合亲和力和特异性。另外，环肽的表面积较大，在降低吉布斯自由能的熵项中起着重要作用，使这些分子以非常高的亲和力与多种不相关的受体结合[2]，并且环肽比直线肽缺少了氨基和羧基末端官能团，使整体结构更耐降解，延长作用时间。在过去的几十年中，自然界中已经发现1 000余种环状肽，其中临床上已经批准了超过40种环肽药物[3]，并且平均每年大约有一种新的环肽药物进入市场，包括最早应用于临床的短杆菌肽S、万古霉素、激素类、催产素等。在本文中，笔者结合国内外研究现状，总结了目前已应用或潜在应用于临床的环肽药物，对环肽在抗菌，抗癌，抗真菌，抗病毒等药理活性方面进行讨论，因篇幅有限，部分相关环肽[4-14]本文并未详细列举。

1 抗菌环肽

1944年，英国科学家首次在土壤细菌 Bacillus brevis中发现短杆菌肽S(gramicidin S，GS)的存在，并在之后的几年里确定其晶体结构和作用机制[15]。继GS之后，科研人员又发现许多天然抗菌环肽，万古霉素是一种经典而功能强大的环状糖肽抗生素，于1958年被FDA批准上市，作为治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌血症的一线抗生素用药[16]。万古霉素的结合靶标不是某些特定的酶，而是含有N-Ac-glucosamine (NAG) 和N-Ac-muramic acid (NAM)的肽。这种结合作用可能抑制NAG和NAM聚合物的生物合成，并进一步阻止形成细菌细胞壁的骨干结构。此外，万古霉素还可能影响交联酶的功能，并进一步影响细菌细胞壁的交联。目前万古霉素已经在临床中广泛使用了近60年[17]。达托霉素是一种从土壤细菌玫瑰链霉菌中分离出来的环状脂肽抗生素[18]。自2003年获得FDA批准以来，达托霉素一直被用于治疗革兰阳性细菌引起的严重感染。在临床上，它被认为是抵抗耐药病原体的最后手段。达托霉素包含13个氨基酸残基，其中10个组成环状骨架，其他3个残基(L-Trp，D-Asn和L-Asp)与癸酰基脂质体一起形成环状长链。见图1。

Teixobactin于2015年被Ling等[20]首次报道，属于一类新的环肽抗生素，在细胞培养中发现该类环肽和大多数抗生素肽不同，teixobactin是通过一种名为“iChip”的新型多通道技术从以前无法培养的细菌中分离出来的。Teixobactin对革兰阳性病原体具有显著的抗菌活性，包括耐青霉素的链球菌肺炎(PRSP)，耐万古霉素的肠球菌(VRE)和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)。Teixobactin包含11个氨基酸，其中4个氨基酸残基形成十肽环。在所有残基中，有5个非天然氨基酸，包括L-Allo-enduridineidine，N-Me-D-Phe，D-Gln，D-Thr，和D-Allo-Ile。许多机制研究证明，teixobactin与万古霉素相似，为细胞壁合成抑制剂，并证实脂质Ⅱ和脂质Ⅲ是teixobactin的两个结合靶点，所以该药可能具有双重抗菌功能，且很难对其产生耐药性。见图1。

除天然存在的环肽外，人们还通过化学修饰的方法合成一系列半合成的环状脂糖肽[21]，包括特拉万星，达巴万星和奥利万星等(以特拉万星为代表)，这三种新抗生素与万古霉素属于同一种类，均包含5个固定残基的共同七肽核心，这些核心充当D-Ala-D-Ala靶标的主要结合位点，且均含有亲脂性侧链，这些药物与其靶标的结合会阻止肽聚糖前体在细菌细胞壁中的转肽作用。通过微调它们对不同细菌菌株或不同药代动力学特性的活性，其结构上的细微变化会引起药理作用的细微差异。Armaganidis等[22]发现POL7080是作用于铜绿假单胞菌所特有的抗菌环肽，与其他环肽不同，它是通过肽库合成和筛选增强抗菌活性的多次迭代开发的，通过D-Pro-L-Pro b-turn基序(Polyphor专有PEM技术的基础)稳定其二级结构后，并通过氨基酸取代进行了几轮优化，新的14个氨基酸的肽显示出减少的细胞裂解，但对铜绿假单胞菌具有高活性和选择性。对有效抗生素的分析显示与膜蛋白LptD结合，参与膜生物的发生，因此证明了前体的新作用方式。一项1期临床试验确定了POL7080的临床安全性和耐受性，目前该抗生素正在2期评估中，以治疗铜绿假单胞菌感染[23]。见图1。

Hover等[24]通过一种与培养无关的土壤微生物组筛选策略，发现了两种钙依赖性抗生素Malacidin A和B(Fig.1E)。它们对革兰阳性细菌表现出广泛的活性，包括耐多药金黄色葡萄球菌USA300，耐万古霉素的金黄色葡萄球菌NRS146(VISA)和屎肠球菌(VRE)。Hashizume等[25]从土壤放线菌菌株Amycolatopsis sp.ML1-hF的发酵液中发现帕加米星A，B，C和D抗菌环肽。其中帕加米星A和C对革兰阳性细菌(包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和耐万古霉素的肠球菌(VRE)显示出优异的抗菌活性，而帕加米星B和D对这些细菌的抗菌活较弱，但这四种环肽对革兰阴性菌均没有活性。Kitani等[26]发现从海洋放线菌菌株Streptomyces sp.GKU 220中分离出抗菌环二肽rakicidinF。在后期抗微生物活性测定中发现rakicidinF在剂量为25 μg的浓度时对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌具有抑制活性作用。见图1。

图1 抗菌环肽化学结构式

2 抗癌环肽

临床药理学证明，抗肿瘤活性肽比传统的药物效果更好，更易于吸收且毒副作用小。一般由20～30个氨基酸残基组成，可特异性的与肿瘤细胞结合，直接或间接抑制肿瘤细胞，诱导凋亡。嗜冷菌素A-H是从不同的青霉菌株中发现的环三肽[27]。有数据显示，嗜冷菌素D对P388鼠白血病细胞(ID50=10.1 μmol/L)具有可接受的抗癌活性范；嗜冷菌素G显示出对HepG2肝癌细胞具有明显的降脂能力(IC50=10 μmol/L)；而嗜冷菌素E对HCT116(结肠)细胞系(IC50=28.5 μmol/L)表现出选择性抗增殖活性，比顺铂(IC50=33.4 μmol/L)更有效[28]，其他嗜冷菌素没有生物学活性。Wewakazole B是一种抗肿瘤环十肽，来自红海Moorea Produces菌株的次生代谢产物[29]。在随后的铁载体检测中，证明该环肽是非活性的，并使用MS和NMR技术验证其结构。裸藻肽A和B是从蘑菇裸藻(Gymnopus fusipes)中分离出的两个高度N甲基化的环肽。Ványolós等[30]发现裸藻肽A和B在许多人类癌细胞系(例如皮肤表皮细胞系(A431)，宫颈细胞系(Hela)和乳腺癌细胞系(MCF7，T47D和MDAMB-231)中显示出潜在的抗增殖活性。两种环肽都比对照品顺铂至少高出两个数量级。Reniochalistatin A-E是一种从中国南海永兴岛采集的海生海绵Reniochalina stalagmitis中分离的四种环七肽和一种环八肽[31]，对五种不同的人类癌细胞系(RPMI-8226，MGC-803，HL-60，HepG2和HeLa)测试了Reniochalistatin A-E。研究结果表明，环状八肽Reniochalistatin E对骨髓瘤RPMI-8226和胃MGC-803细胞具有生物活性，IC50值分别为4.9 μmol/L和9.7 μmol/L。但是对白血病HL-60和肝癌HepG2(IC50> 20.0 μmol/L)和宫颈HeLa(IC50> 17.3 μmol/L)细胞无活性，另外四种七肽(A-D)对测试细胞显示无活性。见图2。

图2 抗癌环肽的化学结构式

ALRN-6924是一种基于订书肽的MDM2和MDMX的双重抑制剂，其作用之一是可中断p53的抑制并恢复肿瘤细胞中正常p53介导的细胞活性[32]。该种环肽通过在同一面上桥接两个氨基酸侧链，以增加稳定性，除此之外，该过程还可以促进肽细胞的渗透性。目前，ALRN-6924正在对p53蛋白干预的晚期实体瘤或淋巴瘤患者进行2期试验，以及针对急性髓细胞性白血病或晚期骨髓增生异常综合症患者的1期试验。

3 抗真菌肽

Nakamura等[33]从真菌菌株MF-347833.83的培养液中分离出一种抗真菌环状六肽：ASP2397，该化合物的结构类似于异羟肟酸酯铁氧体，具有螯合铝离子的能力，并对曲霉菌种表现出有效的抗真菌活性，在高浓度(50 μg/ml)下对哺乳动物细胞无细胞毒性作用，且ASP2397比其他衍生物更易溶，并显示出更大的药物开发潜力。Colisporifungin是一种在尚未报道过的Colispora cavincola液体培养液中发现的新型环状去脂肽[34]，结果发现，剂量为2 μg/ml的Colisporifungin可诱导卡泊芬净对病原性真菌产生很强的抗真菌活性，从而使卡泊芬净的IC50从约33 nmol/L降至6.2 nmol/L，效能提高5.3倍。此外，当针对白色念珠菌进行测试时，剂量为1 μg/ml的Colisporifungin会降低卡泊芬净的IC50。Theonellamide G是从埃及洪加达红海沿岸的海绵Theonella swinhoei中分离出来的一种双环糖肽[35]，它对白色念珠菌和两性霉素B的耐药菌株表现出有效的抗真菌活性(IC50=4.49 μmol/L；2.0 μmol/L)。此外，它还对人结肠癌细胞系(HCT-116)具有优异的细胞毒活性，IC50为6.0 μmol/L[36]。Ma等[37]在tamarii培养液中发现二硫环-(Leu-Val-Ile-Cys-Cys)的环状五肽，以及名为malformin E的五肽，该种环肽除了表现出有效的抗癌作用外，还显示了对枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和大肠杆菌的潜在抗菌活性，对白色念珠菌和茄形镰刀菌的抗真菌MIC值分别为0.91、0.45、1.82、0.91、3.62、7.24和7.24 μmol/L。见图3。

图3 抗真菌肽的化学结构式

4 抗病毒环肽

Aspergillipeptide D是一种环状五肽，是由真菌曲霉属(Aspergillus sp.)的培养液中分离出来的[38]。Aspergillipeptide D在对Vero细胞系(IC50=9.5 μmol/L)的非细胞毒性浓度下，对1型单纯疱疹病毒(HSV-1)表现出良好的抗病毒活性。它还显示出对HSV-1-106和HSV-1-153(对阿昔洛韦有抗药性的临床分离株)具有近50%的抗病毒活性。Liang等[39]在深海衍生的真菌菌株Simplicillium中分离了一个新的线性肽Simplicilliumt I和4个新的环状肽Simplicilliumtides J-M，发现环肽Simplicilliumtides J对Aspergillus versicolor和Curvularia australiensis表现出显著的抗真菌活性和抗HSV-1作用，IC50值分别为14.0、16.7和15.6 μmol/L，并讨论内酯键和脂肪酸链片段的取代基对这些类型环肽的生物活性影响。Simplicilliumtides K是从深海来源的菌株Simplicillium obclavatum EIODSF 020.87中发现的[39]。它对HSV-1表现出有效的抗病毒活性，IC50值为14.0 μmol/L，并且还对黑云藻表现出明显的抗真菌活性。有相关研究利用计算机筛选与人免疫缺陷病毒1型转录反转录激活因子(HIV-1 Tat)缀合的商业环肽配体，通过分子对接和分子动力学技术模拟与埃博拉病毒抑制剂的偶联作用，该研究团队从313个商业环肽和一个HIV-1 Tat肽中修饰了614个配体，最终得到配体023是与HIV-1 Tat结合来抑制埃博拉病毒的最佳环肽[40]。见图4。

图4 抗病毒环肽的化学结构式

5 其他环肽

在过去的几年中，还报道了许多具有其他生物活性的环肽。从链霉菌属菌种的培养物中获得了两个环状肽[41]，称为Pentaminomycin A和B， Pentaminomycin A通过减缓酪氨酸酶，酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)等黑色素生成酶的表达来抑制α-MSH刺激的黑色素的合成。从波罗的海蓝藻提取物中提取的具有生物活性的环状六肽Anabaenopeptins 1,该物质包含Dolichospermun spp.(10%),Aphanizomenon flos-aquae (40%)和Nodularia spumigena (50%)。它们均对蛋白质磷酸酶1和羧肽酶A表现出抑制作用，但对胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和凝血酶没有抑制作用[42]。最后，FDA近年来批准上市的第一个从头开发的药物是peginesatide，该药用于治疗无法使用促红细胞生成素[23]所导致的严重贫血。另有研究中通过针对红细胞生成素的噬菌体逐级筛选而发现的受体[43]。

然后将其与聚乙二醇(PEG)发生二聚，从而增加血液中的亲和力，效力和循环时间，但是遇到临床试验中的许多问题，在批准一年后自愿退出市场。除这些化合物外，最近还报道了许多其他生物活性环肽。例如，内环化合物A和B是两个环状四肽[44]，分别对血管加压素受体1A和5-羟色胺受体5HT2b表现出良好的亲和力90，具有显著的降脂作用。Kaneda等[45]发现环亚麻肽(CL)除了具有抗疟和免疫抑制作用之外，还具有破骨细胞分化抑制活性，该小组利用TRAP活性作为破骨细胞分化的指标，筛选了在先前的植物化学研究中分离出的化合物，结果发现，环亚麻肽所显示出的破骨细胞分化抑制活性能力明显强于阳性对照(姜黄素：IC50 7.50 lM，伊普黄酮：IC50 17.2 lM)。Dishon等[46]筛选出一种新型环肽蛋白模拟物c(MyD 4-4)来抑制TLR配体的炎性反应以及对NF-kB进行激活，该种环肽可以特异性地阻断髓样分化因子(MyD88)，防止MyD88二聚化，以及降低小鼠多发性硬化症。因此，使用c(MyD 4-4)调节MyD88依赖性信号传导是降低自身免疫性CNS疾病先天性免疫不良反应的潜在治疗策略。见图5。

综上所述，长期以来，由于其治疗潜力，人们一直对天然来源的环肽给予了极大的关注。天然环肽具有抵抗细菌和病毒感染的作用，从而克服了日益增加的抗生素耐药性现象。但是在环肽治疗剂的开发中仍然存在一些重要的挑战，其中两个最重要的挑战是口服有效性和细胞通透性。近年来应用的创新方法解决了这些挑战中的部分问题，包括使用细胞穿透性肽、具有烃接头的α-螺旋构象稳定化的肽、N-甲基化的体外进化肽等。根据目前国内外研究现状，开发具有良好口服利用率并通过被动扩散有效进入细胞的环状肽，可能有必要考虑分子量较小且肽键较少的肽。

图5 其他环肽的化学结构式