余甘子多酚纯化工艺研究及组分分析

孟令志，王佳慧，王甄洁，孙晗，李云飞，张雅捷，夏宁，谢春阳

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130000）

余甘子又称为庵摩勒、望果、久如拉等，是大戟科落叶灌木的干燥果实[1]，作为药食同源的材料[2]，含有氨基酸[3-4]、油脂[5]、糖类物质[6]、维生素[7]及多酚类物质[8]。其中多酚类物质包括没食子酸、柯里拉京、鞣花酸、诃子林鞣酸等[9-11]，具有抗癌、消炎、抗菌等作用。余甘子多酚经超声提取后，纯度较低，对其后续研究影响较大，需进行纯化处理，而大孔树脂作为吸附分离介质，具有吸附性好、稳定性高、可再生等优点，在工业脱色、活性物质分离纯化等领域已广泛应用[12]。本试验采用大孔树脂纯化法，在6种大孔树脂中筛选出对余甘子多酚纯化效果良好的树脂，并确定最佳吸附-解吸条件，对纯化后的多酚采用高效液相色谱法测定具体成分及含量[13]。为工业化生产其多酚类物质及成分分析提供参考。

1 材料与试剂

1.1 试验材料

新鲜余甘子：福建惠安采摘园，采摘后立即运送至实验室进行预处理。

1.2 试验试剂

福林酚（分析纯）：上海蓝李科技发展有限公司；没食子酸、无水乙醇（均为分析纯）、甲醇（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；诃子林鞣酸、柯里拉京、鞣花酸（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；X-5、D101、S-8型大孔树脂：东鸿化工有限公司；AB-8型大孔树脂：安徽皖树化工销售有限公司；D1400型大孔树脂：郑州和成新材料科技有限公司；XAD-7HP型大孔树脂：美国ROHM AND HAAS公司。

1.3 仪器与设备

U3000高效液相色谱仪：赛默飞世尔科技公司；BS-100自动部分收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司；PHS-25酸度计：上海理达仪器厂；层析柱（1.6 cm×20 cm）：上海亚荣生化仪器厂；CX-HL-20004F恒流泵：上海瓷熙仪器仪表有限公司；BSD-YX（F）3200立式智能精密摇床：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司。

2 试验方法

2.1 原料处理

运用超声波辅助法对余甘子多酚进行提取，将浓缩后的提取液冷冻干燥，获得余甘子多酚冻干粉，并对其多酚含量进行测定。

2.2 标准曲线的绘制

余甘子多酚浓度使用福林酚法测定[14]，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2.3 大孔树脂预处理

使用无水乙醇对 X-5、D-101、S-8、AB-8、D-1400、XAD-7HP大孔树脂进行活化，搅拌至无气泡产生，静置24 h使其活化充分后，用蒸馏水将树脂中乙醇洗净[15]。

2.4 大孔树脂的筛选

称取5 g大孔树脂于锥形瓶中，加入2.5 mg/mL余甘子粗多酚溶液50 mL，置于摇床上静态吸附24 h，测定上清液中多酚质量浓度，按公式（1）、（2）计算吸附量、吸附率[16]。

吸附后的大孔树脂表面残留多酚使用蒸馏水洗净，加入50 mL 85%乙醇溶液，置于摇床上静态解吸24 h，测定上清液中多酚质量浓度，按公式（3）计算解吸率[17]。

式中：Q为吸附量，mg/g；C0为吸附前多酚质量浓度，mg/mL；C1为吸附后多酚质量浓度，mg/mL；C2为解吸后多酚质量浓度，mg/mL；V1为多酚溶液体积，mL；V2为乙醇溶液体积，mL；m为树脂质量，g。

2.5 XAD-7HP大孔树脂静态吸附-解吸条件优化

称取XAD-7HP大孔树脂5 g于锥形瓶中，分别加入 1、2、3、4、5 mg/mL 的余甘子多酚溶液 50 mL，置于摇床上静态吸附，充分吸附后测定上清液中多酚质量浓度，筛选最佳上样液质量浓度。

配制 pH 值为 2、3、4、5、6、7，质量浓度为 4 mg/mL余甘子多酚溶液，称取XAD-7HP大孔树脂5 g于锥形瓶中，分别加入多酚溶液50 mL后，置于摇床上静态吸附，充分吸附后测定上清液中多酚质量浓度，筛选最佳上样液pH值。

吸附后的XAD-7HP大孔树脂使用蒸馏水将表面残留多酚洗净，分别加入55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液50 mL后，置于摇床上静态解吸，充分解吸后测定上清液中多酚质量浓度，筛选最佳解吸乙醇体积分数。

配制 pH 值为 2、3、4、5、6、7、8、9、10 的乙醇溶液，重复上述步骤，筛选最佳解吸液pH值。

2.6 XAD-7HP大孔树脂动态吸附-解吸条件优化

湿法装柱XAD-7HP大孔树脂于1.6 cm×20 cm的层析柱，将样液分别以1、2、3、4、5mL/min速度通过恒流泵上样，进行动态吸附，收集流出液（5 mL/管），测定管中多酚质量浓度，计算泄漏点体积[18]，确定最佳上样流速及上样体积。达到平衡后，使用蒸馏水以相同流速洗柱直至无色，用苯酚硫酸法每50 mL测定多糖浓度，考察洗脱液体积。当杂质洗净后，以 1、2、3、4、5mL/min 速度将解吸液注入层析柱中解吸，收集流出液（5 mL/管），测定流出液多酚质量浓度，确定最佳解吸液流速。

2.7 余甘子多酚纯度测定方法

称取一定量的余甘子粗多酚冻干粉和经过纯化后的余甘子多酚冻干粉，配制成溶液按步骤计算余甘子多酚质量浓度后，按公式（4）计算余甘子多酚纯度。

式中：C0为多酚质量浓度，mg/mL；V为溶液体积，mL；m 为冻干粉质量，mg。

2.8 余甘子多酚组分分析

采用高效液相色谱法测定多酚组分，称取0.01 g纯化后的余甘子多酚冻干粉，甲醇为溶剂，定容于5 mL棕色容量瓶中，然后经过C18固相萃取小柱，收集3 mL后的流出液，用0.22 μm滤膜过滤，加入棕色进样瓶，用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析测定余甘子多酚组分。以对照品色谱图的保留时间为参考，进行分析鉴定其中的有效成分，并通过外标法计算各组分的含量[19]。

色谱条件：Diamonsil C18色谱柱；柱温30℃；总流速 1 mL/min；进样量 10 μL；检测波长 270 nm；流动相A为甲醇，流动相B为0.2%醋酸溶液。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure

2.9 数据统计分析

试验数据利用 Excel 2010、SPSS 17.0、Origin 2018及Design-Expert 8.0.6进行分析及绘图。

3 结果与分析

3.1 没食子酸标准曲线及线性方程

没食子酸标准曲线如图1所示。回归方程为y=104.050 0x+0.045 8，R2=0.999 3，线性关系良好。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve

3.2 大孔树脂的筛选结果

6种大孔树脂对余甘子多酚的静态吸附与解吸结果见表2。

表2 6种大孔树脂对余甘子多酚的静态吸附与解吸结果Table 2 Static adsorption and desorption results of polyphenols from Phyllanthus emblica L.by six macroporous resins

由表2可以看出，S-8、XAD-7HP大孔树脂的吸附效果较好，在解吸方面XAD-7HP的解吸效果明显高于其余5种大孔树脂，综合考虑，余甘子多酚的纯化材料选择XAD-7HP大孔树脂。

3.3 XAD-7HP大孔树脂静态吸附-解吸结果与分析3.3.1 余甘子多酚质量浓度对吸附量的影响

余甘子多酚质量浓度对吸附量的影响见图2。

图2 余甘子多酚质量浓度对吸附量的影响Fig.2 Effect of polyphenol concentration of Phyllanthus emblica L.on adsorption capacity

由图2可知，随着多酚质量浓度的增加XAD-7HP大孔树脂对余甘子多酚的吸附量呈先上升后下降的趋势，余甘子多酚质量浓度为4 mg/mL时，大孔树脂的吸附量最大为（30.18±0.12）mg/g，当余甘子多酚的质量浓度大于4 mg/mL时，吸附量降低，这是由于当余甘子多酚质量浓度过大时会在层析柱内产生絮状物沉淀，阻塞树脂空隙，同时杂质的含量也在增加，和余甘子多酚争夺XAD-7HP大孔树脂的活性位点；而低质量浓度的余甘子多酚会使XAD-7HP大孔树脂吸附活性降低。所以，XAD-7HP大孔树脂对余甘子多酚进行纯化时选定质量浓度为4 mg/mL最佳。

3.3.2 余甘子多酚溶液pH值对吸附量的影响

余甘子多酚溶液pH值对吸附量的影响见图3。

图3 余甘子多酚溶液pH值对吸附量的影响Fig.3 Effect of pH value of Phyllanthus emblica L.polyphenol solution on adsorption capacity

由图3可知，XAD-7HP大孔树脂的吸附量随着余甘子多酚溶液pH值的增大先增加后减少，当余甘子多酚溶液pH值为3时，吸附量最大为（31.76±0.16）mg/g，而余甘子多酚多为酚酸类，在酸性条件下会以分子形式存在，利于XAD-7HP大孔树脂对其吸附；多酚分子本身呈微极性，其极性会随着pH值的不同而改变，从而影响其与XAD-7HP大孔树脂之间的吸附作用。综上所述，XAD-7HP大孔树脂对余甘子多酚进行纯化时样液的pH值为3最佳。

3.3.3 解吸液体积分数对XAD-7HP大孔树脂解吸效果的影响

解吸液体积分数对XAD-7HP大孔树脂解吸效果的影响见图4。

图4 乙醇体积分数对XAD-7HP大孔树脂解吸效果的影响Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on desorption effect of XAD-7HP macroporous resin

由图4可知，XAD-7HP大孔树脂的解吸率与乙醇体积分数呈正相关，当乙醇体积分数95%时，解吸率最大为（90.47±0.97）%。这是因为随乙醇体积分数的增大，溶剂的极性减小，与树脂的极性更加相近，余甘子多酚越容易从树脂上洗脱下来。综上所述，对XAD-7HP大孔树脂进行解吸时所选乙醇溶液的体积分数为95%最佳。

3.3.4 解吸液pH值对XAD-7HP大孔树脂解吸效果的影响

解吸液pH值对XAD-7HP大孔树脂解吸效果的影响见图5。

图5 乙醇溶液pH值对XAD-7HP大孔树脂解吸效果的影响Fig.5 Effect of pH value of ethanol solution on desorption effect of XAD-7HP macroporous resin

由图5可知，XAD-7HP大孔树脂随着乙醇溶液pH值的增加，解吸率先增大后减小，pH值为7时，解吸率达到最大为（90.61±0.97）%；当乙醇溶液pH值大于7时，解吸率急速减小。造成此种现象一方面可能是在酸性条件下，溶液的极性较大，XAD-7HP大孔树脂属于弱极性，致使余甘子多酚不易脱离，导致解吸率较低；另一方面是在碱性条件下，余甘子多酚分子与碱发生反应，致使多酚含量减少，解吸率降低。所以，对XAD-7HP大孔树脂进行解吸时所选乙醇溶液的pH值定为7最佳。

3.4 XAD-7HP大孔树脂动态吸附-解吸结果与分析

3.4.1 上样流速对XAD-7HP大孔树脂吸附效果的影响

上样流速对XAD-7HP大孔树脂吸附效果的影响见图6。

图6 不同流速的动态吸附曲线Fig.6 Dynamic adsorption curves at different flow rates

树脂进行动态吸附时，当流出液中多酚质量浓度为原液的10%时，定为泄漏点，即吸附终点，上样液质量浓度为4 mg/mL。由图6可知，当上样流速分别为1、2、3、4、5 mL/min时，其泄漏点出现时上样体积分别在400、310、210、150、95 mL。上样流速过快，使大孔树脂对余甘子多酚的吸附不充分，降低吸附效果，而上样流速过低，会增加试验周期。综合以上因素，在XAD-7HP大孔树脂对余甘子多酚进行动态吸附时上样流速为2 mL/min最佳，此时最佳上样体积为310 mL。

3.4.2 蒸馏水洗脱用量对除杂效果的影响

蒸馏水洗脱用量对除杂效果的影响见图7。

图7 水洗曲线Fig.7 Water washing curve

由图7可知，随着洗脱体积的增加多糖浓度减小，当洗脱体积为200 mL时，层析柱中多糖基本被洗净，而此时流出液也基本为无色，说明未被吸附的余甘子多酚也被洗出。为了将未被吸附的余甘子多酚、多糖等杂质清洗干净，水洗体积定为300 mL。

3.4.3 解吸流速对XAD-7HP大孔树脂解吸效果的影响

解吸流速对XAD-7HP大孔树脂解吸效果的影响见图8。

图8 解吸流速对洗脱效果的影响Fig.8 Effect of desorption flow rate on elution effect

由图8可知，在相同吸附条件下，随着洗脱流速的增加，余甘子多酚洗脱峰越宽，拖尾现象越重，使得解吸效果变差。而过快的洗脱流速会导致XAD-7HP大孔树脂上的余甘子多酚不能充分溶解，使得洗脱体积增加，造成资源浪费。而洗脱流速过低会延长试验周期，综合考虑，对XAD-7HP大孔树脂进行解吸时，洗脱流速定为2 mL/min，而此时的洗脱体积为280 mL。

3.5 余甘子多酚纯化结果与分析

经显色反应，测得余甘子粗冻干粉中多酚纯度为16.45%，经上述工艺纯化后多酚纯度提高到60.67%，甘瑾等[20]使用NKA-II大孔吸附树脂对余甘子多酚进行纯化，纯化后多酚纯度为36.08%，与其相比，XAD-7HP大孔树脂能够有效提高余甘子多酚纯度。

3.6 高效液相色谱仪分析纯化后余甘子多酚组分结果与分析

纯化后余甘子冻干粉经高效液相色谱分析，根据混合标准品出峰时间，余甘子多酚样品中均有相应峰出现，具体见图9、图10。

图9 混合标准品的HPLC色谱Fig.9 HPLC chromatogram of mixed standard

图10 纯化后余甘子多酚的HPLC色谱Fig.10 HPLC chromatogram of purified Phyllanthus emblica L.polyphenols

经测定，样品中标准品的含量分别为没食子酸72.179 mg/g、柯里拉京35.443 mg/g、柯子林鞣酸42.731mg/g、鞣花酸38.652mg/g。合计占总多酚31.15%，为余甘子中主要多酚类物质。

4 结论

研究比较了 X-5、D101、S-8、AB-8、D1400、XAD-7HP型大孔树脂对余甘子多酚静态吸附-解吸能力，筛选出XAD-7HP树脂对余甘子多酚的纯化效果最佳，并对其纯化工艺进行优化。最佳纯化工艺为上样液浓度4 mg/mL、pH3、上样体积 310mL、上样液流速 2 mL/min，解吸时乙醇体积分数95%、体积280mL、流速2mL/min。

在此纯化工艺条件下余甘子多酚纯度由16.45%提升到60.67%，经HPLC法分析后，冻干粉中没食子酸的含量为72.179 mg/g、柯里拉京的含量为35.443 mg/g、柯子林鞣酸的含量为42.731 mg/g、鞣花酸的含量为38.652 mg/g。本试验可为余甘子多酚工业化生产和其深入研究提供参考。