N6-甲基腺苷的生物学功能及检测技术研究进展

孔玉洁， 王 晨， 何 炳

（中国科学技术大学附属第一医院，安徽 合肥 230001）

表观遗传是指基因的核苷酸序列不变，基因的表达水平发生变化，使表型发生改变的现象，这种现象往往是可遗传的。近几年的研究热点主要集中于细胞核内组蛋白的修饰、核苷酸的化学修饰等方面。有研究结果显示，N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）与哺乳动物的某些病理和生理过程密切相关，如肿瘤的发生发展、胚胎发育等[1]。本文综述了m6A的分子机制、生物学功能以及检测方法。

1 m6A甲基化

m6A修饰是一种发生在腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰。20世纪70年代，学者们第1次观察到m6A甲基化修饰。2011年，学者们发现m6A修饰是动态可逆的过程后，RNA表观组学的研究步入了新的阶段。目前已知的RNA转录后修饰有171种，m6A是大多数哺乳动物细胞中最常见的一种RNA修饰方式。宏观上，m6A在哺乳动物中的表达具有特异性和偏好性；微观上，m6A修饰主要发生在RRACH（[G/A][G＞A]m6AC[U＞A＞C]）共有序列中，且大多数位于转录起始位点、外显子、终止密码子、5'-非翻译区（untranslated region，UTR）、3'-UTR、核糖体相关mRNA和非编码单链RNA等 区域[2]。

2 m6A相关调控蛋白

2.1 m6A甲基转移酶（编码器）

m6A由至少7个组分构成的甲基转移酶复合物催化形成，其中甲基转移酶（methyltransferase like，METTL）3和METTL14是其核心成分，两者均可在体内和体外催化m6A的甲基化修饰过程。METTL3和METTL14通常以二聚体形式结合在一起，共同促进m6A甲基化[3]。肾母细胞瘤1关联蛋白（Wilms tumor 1 associated protein，WTAP）本身没有甲基转移酶活性，但它能对特定的甲基化位点进行精准定位，其通过与METTL3/METTL14复合物相互作用，从而影响m6A甲基转移酶的活性[4]。

2.2 m6A去甲基酶（消码器）

另一种参与m6A甲基化过程的蛋白复合物是m6A去甲基酶，其作用是作为“消码器”，帮助实现RNA的去甲基化过程。1999年，PETERS等[5]在一种融合脚趾突变小鼠体内发现了第1个去甲基化酶——肥胖基因相关蛋白（fatmass and obesity-associated protein，FTO），该酶的发现表明m6A甲基化是动态的、可逆的。在FTO作用于m6A去甲基化时通常会产生2种中间产物：hm6A和f6A[6]。有研究结果显示，甲氯芬那酸可抑制FTO的去甲基化作用[7]。

2013年，第2个m6A去甲基化酶——α-酮戊二酸依赖性双加氧酶同源物5（alk B homolog 5，ALKBH5）被发现[8]。大部分ALKBH5作用于单链RNA特定m6A位点，使其去甲基化[9]。ZHENG等[7]利用RNA原位杂交技术发现敲除ALKBH5基因能促进mRNA出核，证实m6A可能参与了mRNA的出核转运。动物实验结果显示，在小鼠模型中敲除ALKBH5基因，会出现mRNA中的m6A显著升高、精子畸形和睾丸形状异常等现象，表明m6A修饰对动物生殖发育有较大影响[7]。2017年，UEDA等[10]发现了第3种常见于tRNA的m6A去甲基酶——α-酮戊二酸依赖性双加氧酶同源物3（alk B homolog 3，ALKBH3），ALKBH3是一种公认的DNA修复酶，并有可能作为肿瘤的分子标志物。

2.3 m6A结合蛋白（读码器）

m6A甲基转移酶对RNA进行甲基化修饰后，需要m6A甲基结合蛋白作为“读码器”发挥作用。m6A甲基结合蛋白的种类繁多，主要包括YTH结构域家族、核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HNRNP）家族和真核起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF）等[11]。YTH N6甲基腺苷RNA结合蛋白（YTH N6-methyladenosine RNA binding protein，YTHDF）1可与mRNA终止密码子附近的m6A位点结合，从而促进RNA翻 译[12]。而YTHDF2通过募集一种叫作CCR4-NOT的腺苷酸酶复合物，来促进m6A修饰的转录产物的降解[11]。YTHDF3能够与YTHDF1结合，共同作用于甲基化mRNA的翻译过程，同时还通过与YTHDF2的相互作用加速RNA降解[13]。YTH结构域蛋白（YTH domain-containing，YTHDC）1通过募集或限制不同的剪接因子来促进外显子剪接，还可与富含丝氨酸/精氨酸剪接因子3（serine and arginine rich splicing factor 3，SRSF3）和核RNA输出因子1（nuclear RNA export factor 1，NXF1）相互作用，促进m6A甲基化mRNA的核输出[14]。YTHDC2可以通过在共有基序内优先结合m6A，从而促进翻译进程，并减少目的mRNA的含量[15]。HNRNPA2B1通过与m6A甲基化转录本结合来促进miRNA的加工和成熟，HNRNPC和HNRNPG也能调节RNA的丰度和剪接[16]。此外，eIF3能够与mRNA 5'-UTR中的某些m6A甲基化位点结合，提高mRNA的翻译效率[17]。

3 m6A修饰的生物学影响

随着表观遗传学的发展，越来越多的研究结果表明，m6A修饰可在转录后水平多方面影响RNA的生物学功能，如翻译、剪切、运输、定位等，从而影响整个生物体的生长发育阶段，如脑发育、免疫系统成熟等。

3.1 m6A对mRNA剪切及核输出的影响

m6A在前体mRNA中的含量比在成熟mRNA中丰富，且往往集中分布于内含子中[18]。如果敲除FTO，在前体RNA剪接过程中会出现外显子跳跃现象，且3'末端的外显子表达上调[20]。除此之外，METTL16可以甲基化RNA的3'-UTR，从而调控3'-UTR与mRNA 5'端剪切位点结合，并影响其剪切[20]。在METTL3缺失的情况下，核输出往往会受到抑制[19]。

3.2 m6A对mRNA翻译的调节作用

YTHDF1与YTHDF3可结合被m6A修饰的mRNA，并招募eIF3和eIF4A3，以提高CAP依赖翻译的效率[21]。胰岛素样生长因子2可通过提高mRNA的稳定性来促进mRNA的翻译[22]。METTL3可通过与核糖体结合，促进翻译起始复合物组装，还可通过与eIF3h的结合，促进mRNA翻译环的形成、核糖体的循环利用和翻译[23]。

3.3 m6A对mRNA降解的调节

RNA上的m6A修饰能够影响mRNA的稳定性，如YTHDF2可结合目标mRNA上的m6A位点，从而促进RNA降解[11]。

4 m6A修饰的生物学功能

越来越多的研究结果表明，m6A修饰参与了RNA生命功能的各个方面，进而影响真核生物性别决定、T细胞免疫、生物节律、肿瘤发生等多种生物学进程。

4.1 m6A调控脑发育

m6A相关的调控蛋白在突触功能、轴突再生、神经干细胞自我更新，以及小脑发育中发挥着重要功能。动物实验结果显示，特异性敲除小鼠METTL14后，小鼠大脑皮层的发育会受到严重影响；而特异性敲除METTL3后，小鼠可能会出现严重的运动功能障碍，导致哺乳期死亡[24]。如果增加小鼠的学习训练量，小鼠前额叶中m6A水平也随之增加，如果在乳鼠的皮层及海马区条件性地敲除METTL3，会导致小鼠学习能力明显下降[25]，提示m6A修饰可能会影响小鼠记忆形成。此外，m6A也可被定位到树突中，影响突触的可塑性[26]。

4.2 m6A调控造血干细胞的定向分化

脊椎动物的造血干细胞是由生血内皮细胞通过内皮-造血转化过程定向分化而来。m6A修饰可参与调控胚胎干细胞的分化。在斑马鱼胚胎中，METTL3缺失会影响内皮-造血转化过程，使其不能发挥正常的生理作用；另外，m6A还可通过YTHDF2维持内皮-造血转化过程的平衡，进而调控造血干细胞的定向分化[27]。

4.3 m6A与肿瘤

m6A修饰在不同类型的肿瘤中起着不同的作用。因此，了解调控m6A甲基化修饰的基因，探索m6A相关蛋白在肿瘤发生过程中的影响和功能，对探索肿瘤发病机制和临床治疗有重要作用。目前已报道的m6A修饰相关蛋白表达水平与肿瘤发生、发展的关系见 表1。

表1 m6A 修饰相关蛋白表达水平与肿瘤发生、发展的关系

4.3.1 m6A修饰抑制肿瘤进展 在GBM中，解整合素样金属蛋白酶19（a disintegrin and metalloproteinase 19，ADAM19）的m6A修饰降低会增强其表达，促进GBM干细胞的生长和自我更新，并最终导致肿瘤的发生。在肝细胞肝癌中，m6A水平降低会破坏miR-126的肿瘤抑制功能，从而加速肿瘤的进展。FTO介导的m6A甲基化下调会导致肿瘤抑制因子表达降低，从而导致白血病发生。总之，某些肿瘤的发展可能与RNA甲基化水平降低有关。

4.3.2 m6A修饰促进肿瘤进展 在AML中，m6A水平升高提高了mRNA的稳定性，促进了AML的发生、发展。在肝癌中，细胞因子信号转导抑制因子2（suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2）的m6A修饰增强可促进其降解，从而加速肿瘤进展。此外，在乳腺癌中，乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白（hepatitis B virus X interacting protein，HBXIP）的m6A甲基化上调会加速肿瘤发生。总之，RNA甲基化水平上调会导致肿瘤特异性癌基因表达和生物学功能的改变，从而促进某些肿瘤发展。

5 m6A的检测技术

mRNA中m6A甲基化修饰对核苷酸上的碱基配对无影响，因此用逆转录技术难以检测到m6A。薄层层析、斑点杂交和液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等方法虽然能检测到转录组中m6A的分布，但因其对物理和化学技术要求过高，很难检测出整个转录组水平上的m6A分布。m6A检测方法主要有10种：RNA甲基化测序（N6-methylated RNA sequencing，m6A-Seq）、RNA甲基化免疫共沉淀高通量测序（methylated RNA immunoprecipitation sequencing，MeRIP-Seq）、二维薄层色谱（two-dimensional thin layer chromatography，2D-TLC）、斑点杂交、LC-MS/MS、位点特异性切割-放射性标记-连接辅助提取-薄层色谱（site-specific cleavage and radioactive-labeling followed by ligation-assisted extraction and thin-layer chromatography，SCARLET）、光交联辅助m6A测序（photo-crosslinking-assisted m6A sequencing，PA-m6A-Seq）、m6A单碱基分辨率紫外交联沉淀结合高通量测序（m6A individual-nucleotideresolution cross-linking and immunoprecipitation combined with high-throughput sequencing，mi-CLIP-Seq）、m6A水平和异构体鉴定测序（m6Alevel and isoform-characterization sequencing，m6ALAIC-Seq）、DpnI辅助N（6）-甲基腺嘌呤测序（DpnI-assisted N6-methyladenine sequencing，DAm6A-seq）。10种检测方法的优缺点见表2。

表2 10种m6A检测方法的优缺点

6 展望

除4种正常的核苷酸外，RNA还有大量被修饰过的核苷参与其组成。修饰核苷是表观遗传学的一种，是一种可遗传、可逆的变化，且变化在遗传基因组前发生，一般发生于肿瘤发展的早期阶段。m6A过度修饰或修饰水平降低都可能会导致肿瘤的发生。一般来说，未被修饰的核苷酸可以被反复利用，如被磷酸酯化后继续参与合成新的核苷酸，或被降解产生β-丙氨酸和尿酸。而被修饰的核苷酸非常稳定，不容易被代谢或被磷酸酯化再利用，而是被核酸酶酶解后经尿液排出。因此，理论上检测尿液或血液中的修饰核苷酸是早期诊断、监测肿瘤的有效方法。有研究结果显示，分别检测随机尿核苷酸和肌酐，用核苷酸/肌酐比值可以衡量尿中被修饰的核苷酸量[36-37]。

关于修饰核苷酸，目前大部分研究均集中于检测癌组织细胞的m6A水平。目前，病理学是诊断肿瘤及其分期的重要标准。当组织细胞处于病理学的临界，难以确定或难以分期时，如能精确定量检测人体血液、尿液等体液或排泄物中的m6A，并阐述其与肿瘤之间的关系，将有助于肿瘤的精确诊断。