基因芯片技术在肾移植术后患者肺部感染病原菌 快速检测中的临床价值

李达明， 吕 星， 蒋传好， 胡 敏

（中南大学湘雅二医院检验科，湖南 长沙 410000）

为了防止移植排斥反应，肾移植术后患者需长期服用免疫抑制剂，这会使机体的免疫功能受到影响，增加感染的风险，其中泌尿系感染最为常见，但是肺部感染的病死率最 高[1]。早期诊断和治疗有助于有效控制病情，但由于接受免疫抑制治疗导致患者免疫功能低下，炎症反应往往不典型，病情很难被及时发现。细菌培养是诊断细菌感染的金标准，但是由于细菌培养周期较长，细菌生长的体内、体外条件不能达到完全相同，导致检出率不高，容易耽误治疗。近年来，分子生物技术已成为传统细菌感染诊断方法的重要补充，也是快速诊断病原菌的主要研究方向。基因芯片技术是一种新型核酸检测方法，在细菌感染检测中具有耗时短、操作简单等优点。本研究将基因芯片技术与细菌培养检测肾移植术后患者肺部感染病原菌的应用效果进行比较，分析基因芯片技术在此类感染中的临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2018年11月—2019年12月中南大学湘雅二医院290例肾移植术后患者[男195例、女95例，年龄（40.87±11.31）岁]的呼吸道样本（痰样本136例、肺泡灌洗液样本152例、咽拭子样本2例）。根据是否发生肺部感染，分为肺部感染组[149例，其中男101例、女48例，年龄（41.56±10.92）岁]和非肺部感染组[141例，其中男94例、女47例，年龄（39.65±10.89）岁]。肺部感染诊断标准根据中华医学会呼吸病学分会2016年发布的《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南》[2]：（1）社区发病；（2）新近出现的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病症状加重，伴或不伴脓痰、胸痛、呼吸困难及咯血；发热；肺实变体征和（或）闻及湿性啰音；白细胞＞ 10×109/L或＜4×109/L，伴或不伴细胞核左移；以上任意1项；（3）胸部X线检查显示片状、斑片状浸润性阴影或间质性改变，伴或不伴胸腔积液。排除肺结核、肺部肿瘤、非感染性肺间质性疾病、肺水肿、肺不张、肺栓塞、肺嗜酸性粒细胞浸润症及肺血管炎患者。本研究经中南大学湘雅二医院伦理委员会审核通过。

1.2 仪器和试剂

北京博奥晶典生物技术有限公司呼吸道病原体核酸检测试剂盒、RTisochip-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪。美国BD公司Phoenix 100全自动微生物分析系统及配套细菌鉴定/药敏板。郑州贝瑞特生物技术有限责任公司哥伦比亚血琼脂培养基、沙保弱葡萄糖琼脂培养基/中国蓝琼脂二分格培养基。江门凯林贸易有限公司嗜血杆菌巧克力琼脂培养基。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 采集患者术后次日晨起后经清水反复漱口后的痰样本136例，经支气管纤维镜冲洗后的肺泡灌洗液样本152例，咽拭子 2例。及时送检。

1.3.2 细菌培养与鉴定 将留取的临床样本接种于哥伦比亚血琼脂培养基和沙保弱葡萄糖/中国蓝二分格培养基、嗜血杆菌巧克力琼脂培养基上，置于35 ℃、5% CO2培养箱中培养18～ 24 h，采用Phoenix 100全自动微生物分析系统及配套细菌鉴定/药敏板进行菌种鉴定。

1.3.3 基因芯片技术检测 采用呼吸道病原体核酸检测试剂盒配套的核酸提取试剂，按照其说明书要求处理呼吸道样本，并进行核酸提取。提取核酸后，采用RTisochip-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪进行扩增，结合配套的软件分析，可一次性检测12种常见呼吸道病原体：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、结核分枝杆菌复合群、肺炎支原体、肺炎衣原体。检测完成后，采用最大二阶导数法结合其他算法计算出“S型”扩增曲线进入快速扩增期的第1个拐点，拐点对应的时刻与原点时刻的差值定义为Tp值，结合Tp值阳性判断值进行结果判读。“荧光曲线区域”显示归一化曲线，“检测结果”区域显示质控结果和各检测指标的检测结果。当检测指标的Tp值≤阳性判断值时，判读为阳性；当检测指标的Tp值＞阳性判断值时，判读为阴性。

1.4 统计学方法

采用 SPSS 25.0 软件进行数据分析。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2种方法检测结果

2 9 0例样本中，细菌培养阳性5 0例（17.24%），包括11种病原菌，以革兰阴性杆菌为主（36株，72.00%），其中肺炎克雷伯菌9株（18.00%）、嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌各6株（12.00%）；基因芯片技术检测阳性84例（28.97%），包括11种呼吸道病原菌，其中肺炎克雷伯菌17株（20.24%）、流感嗜血杆菌和铜绿假单胞菌各16株（19.05%）。见表1。

表1 细菌培养与基因芯片技术阳性检测结果 株

2.2 基因芯片技术、细菌培养检测结果与临床诊断比较

290例患者中，基因芯片技术检出84例阳性、2 0 6例阴性，临床敏感性为6 5.4 8%（55/84），临床特异性为54.37%（112/206）；二者差异有统计学意义（χ2=8.62，P＜0.01）。细菌培养检出50例阳性、240例阴性，临床敏感性为64.00%（32/50），临床特异性为51.25%（123/240）；二者差异无统计学意义（χ2=3.266，P=0.07）。以临床诊断为标准，基因芯片技术的阳性预测值为36.91%（55/149），阴性预测值为79.43%（112/141）；细菌培养的阳性预测值为21.48%（32/149），阴性预测值87.23%（123/141）。见表2。

表2 基因芯片技术、细菌培养检测结果与临床诊断比较例

3 讨论

目前，临床治疗终末期肾脏疾病的方法主要是肾移植术，然而肾移植术往往伴随着很多风险。为尽量避免术后可能产生移植物抗宿主反应和宿主抗移植物反应等排斥反应，患者术后需要长期、大剂量服用免疫抑制剂，导致患者免疫功能低下，易发生一系列可能危及生命的并发症，其中最容易发生的就是感染[1]。有研究结果显示，有70%的肾移植患者术后3年内发生过感染[3]。我国的相关统计数据显示，9%～16%的肾移植患者术后会出现肺部感染[4]，肾移植术后3个月左右是细菌感染的高发阶段，其感染部位多为泌尿系统和呼吸系统，尤其是呼吸系统感染，起病隐匿、进展迅速，病死率为28.3%～37.9%[5-6]，重度肺部感染病死率甚至可达40%～72%[7]。因此，早期确定肾移植患者术后肺部感染的病原菌，可有效帮助临床选用敏感抗菌药物，不仅能够达到更好的治疗效果，还能避免盲目使用大量广谱抗菌药物导致的不良后果。很长一段时间以来，临床微生物实验室确定呼吸系统感染病原菌主要是采用细菌培养的方法，该方法也一直被视为细菌感染检测的金标准。但是细菌培养耗时长，从培养细菌、鉴定，直至得出药物敏感性结果，往往需要超过48 h；此外，由于某些苛养菌在一般的培养基上不能生长，从而存在着较高的漏检风险；同时，临床在肾移植术后常会预防性使用抗菌药物控制感染，也会导致病原菌无法被培养出来，出现假阴性结果，这些都会进一步影响临床治疗效果。

本研究采用基因芯片技术进行肾移植术后肺部感染患者病原菌检测。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等在2000年开发出来的核酸扩增技术，从核酸提取到最终结果报告只需2 h左右，其检测呼吸道病原体阳性率可达40%～60%[8-10]。而目前传统的细菌培养方法阳性结果报告时间为66～115 h[11]，且阳性检出率一般低于20%[12]，故基因芯片技术相对于传统培养方法，大大缩短了检验时间，提高了病原菌检出率，检测效率大幅提高，有助于及时指导临床合理使用抗菌药物。

本研究发现，基于LAMP的快速基因芯片技术更加灵敏，临床敏感性达65.48%，略高于细菌培养（64.00%），其中4株结核分枝杆菌复合群基因芯片技术检测结果为阳性，而细菌培养为阴性。通常来说，结核分枝杆菌培养需要在罗氏培养基上培养42 d才能生长出来，普通的血琼脂培养基的营养条件难以满足该种细菌的生长需求；此外，基因芯片技术检测出流感嗜血杆菌16株、肺炎链球菌4株、肺炎支原体6株、肺炎衣原体3株，而细菌培养均未检出，这很有可能是因为人正常呼吸道中有大量的正常菌群，它们很容易在培养基上生长，从而覆盖了病原菌，使临床漏检率升高。同样，由于感染也有可能是多种病原菌造成的，其中1种致病菌在培养皿上的生长速度更快，会导致微生物检测人员在观察培养皿时遗漏其他病原菌。李辉腾等[13]的研究结果显示，基因芯片技术特异性强、稳定度高，能快速、准确地检出嗜肺军团菌。杨俊发等[14]的研究也证实了基因芯片技术可高灵敏度、高特异性和高稳定性地检出肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌。杨艳兵等[15]发现基因芯片技术检测白念珠菌也有着高灵敏度和高特异性。上述几种非典型肺部感染病原菌在常规条件下难培养，或难以判断是否为致病菌，因此，仅进行常规细菌培养很容易造成漏检。本研究也发现了基因芯片技术的局限性，由于本研究所用基因芯片的设计仅能检测10种临床常见的病原菌，故由其他病原菌导致的感染无法被诊断；细菌培养检出的皮氏伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌、嗜酸假单胞菌、恶臭假单胞菌、头状葡萄球菌、阴沟肠杆菌、抗坏血酸克吕沃尔菌、念珠菌、曲霉菌，该基因芯片均未检出，提示在基因芯片技术和细菌培养的一致性降低的同时，也会导致基因芯片技术的特异性不如细菌培养。

综上所述，基因芯片技术在肾移植患者术后感染病原菌快速检测中有较高的敏感性，但受限于芯片的设计，特异性不理想。建议在肾移植术后患者中若发生可疑肺部感染，可优先应用基因芯片技术来进行初步判断，再通过细菌培养加以证实。