低场核磁共振法测定猪肉中脂肪含量

汤舒越，汤晓艳,，张宇慧，刘素可，黄欣媛，段胜男

（1.南京农业大学食品科技学院，肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏 南京 210095；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

脂肪是畜禽肉中重要营养指标之一，脂肪含量的多少不仅反映了畜禽肉营养品质状态，还关系到肌肉的嫩度、多汁性以及风味等食用品质，此外脂肪的氧化问题还影响贮藏期间畜禽肉品质劣变程度，从而影响产品货架期。目前脂肪含量的检测主要采用GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法，该方法耗时长，操作繁琐，尤其是检测中使用乙醚或石油醚等有机试剂，会对人体和环境造成极大危害和污染。因此，探索高效率、低污染的新型脂肪含量测定方法成为重要课题。目前国内外有不少研究人员探索用近红外光谱技术、超声波技术、计算机视觉技术等检测畜禽肉中脂肪含量，其中近红外技术在肉品快速无损检测方面的操作规范还制定了相关行业标准，但上述方法均基于模型建立的思路，需要收集至少100 个具有代表性的样品，其中同一品种的样品要包含不同性别、不同月龄、不同部位，使脂肪含量范围能够覆盖未来分析的样品特性，由此创建脂肪含量的预测模型，不能直接准确定量。

低场核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技术是在恒定磁场强度为0.5 T以下，研究具有固定磁矩的氢原子核与交变磁场发生能量交换的现象，即弛豫过程。根据物体内部原子核的弛豫特性，实现物质组分的定量和鉴别分析，利用这一原理可以检测粮油种子含油含水率、牛奶掺假、肉类注水注胶鉴别等多个方面。其中，在油脂含量测定方面，有研究发现，食用油的弛豫峰顶点时间在100 ms左右，但在同一弛豫时间段内，除油脂信号外还存在水分信号。Miklos等研究发现，香肠在弛豫时间为60～160 ms时出现的峰包含了脂肪和水分共同的信号。因此，消除水分对脂肪信号的影响是准确定量脂肪含量的关键因素。有学者采用化学计量学方法，通过水油共同信号直接建立预测模型实现对脂肪含量的测定，但化学计量统计需要一定的样本量，方法具有局限性。Sørland等也利用梯度场抑制水分信号对脂肪含量进行测定，但该方法对设备要求高，极大地增加了检测成本。

本实验针对生猪育种养殖以及猪肉营养评价中脂肪含量测定的迫切需求，拟利用烘干方法去除水分，分离低场核磁脂肪信号和水分信号，优化样品质量、烘干时间、回波时间等技术参数，建立LF-NMR技术检测猪肉中脂肪含量的方法，以期改进国标索氏抽提法有机试剂污染危害、抽提耗时长等问题，提供一种绿色环保的畜禽肉中脂肪含量测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪背最长肌、猪油购于北京超市发卖场。将猪背最长肌剔除肉眼可见筋膜，绞成肉糜，置于-20 ℃备用。

NMI20-040V-I型核磁共振成像分析仪（氢谱，共振频率20 MHz，探头线圈直径25 mm） 苏州纽迈分析仪器股份有限公司；Soxtec2050索氏提取仪 丹麦福斯集团公司；OLB-DH100-2型干式恒温器 山东欧莱博仪器有限公司；GZX-9023 MBE型电热鼓风干燥箱烘箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂；AL104型电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基准脂肪含量的测定

参照GB 5009.6—2016，用索氏抽提法测定猪肉样品中脂肪含量，作为基准脂肪含量。

1.2.2 低场核磁信号采集

首先在FID序列下通过仪器自检进行校准，再用CPMG序列采集样品的横向弛豫时间（），经SIRT多组分反演后得到谱图。

CPMG序列检测参数设置为：接收机带宽200 kHz，等待时间2 000 ms，模拟增益20，数字增益3，前置放大增益2，回波个数4 000～9 000。

1.2.3 信号采集参数优化

1.2.3.1 回波时间

经射频脉冲作用后，从横向磁化强度最初产生到接收信号间的时间间隔被称为回波时间。一般要求半回波时间大于6 倍90°脉冲宽度设定值。本研究分别设置回波时间为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 ms，以末尾10 个信号幅值的平均值为最终衰减信号幅值，比较不同回波时间下的衰减程度及弛豫信息。

1.2.3.2 重复扫描次数

重复扫描次数为仪器进行自动重复采样的次数，重复扫描次数会影响样品的信号强度和采样时间，因此需要根据样品的实际信号强弱进行优化选择。本研究设置仪器重复扫描次数为8、16、32、64、128 次，分别比较分析谱图的弛豫特性及信噪比（）。

1.2.4 样品参数优化

1.2.4.1 样品质量

分别称取猪肉糜1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g（精确至0.001 g），105 ℃烘干6 h，恒温50 ℃后采集低场核磁信号，设置回波时间为0.3 ms，重复扫描次数64 次，分析不同样品质量对弛豫特性的影响。

1.2.4.2 烘干时间

取4.0 g（精确至0.001 g）肉糜在105 ℃烘干不同时间（0、2、4、6、8、9、10、11、12 h），恒温至50 ℃后，采集低场核磁信号，分析烘干时间对样品脂肪信号的影响。

1.2.4.3 样品检测温度

取4.0 g（精确至0.001 g）肉糜在105 ℃烘干6 h，将烘干后样品温度分别恒温至32、40、50、60、70 ℃，采集样品低场核磁信号，考察样品温度对弛豫特性的影响。

1.2.5 方法验证

1.2.5.1 重复性

取3 块猪背最长肌，每个样品取6 个平行，根据优化后检测条件进行测定，计算低场核磁脂肪信号峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.5.2 精密度

分别在同一天内不同时间段及不同天内对同一样品进行测定（=6），计算样品脂肪信号峰面积的RSD，考察其日内精密度及日间精密度。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 信号采集参数优化

仪器检测参数主要由2 部分组成，即系统参数和信号采集参数。其中系统参数包括仪器特性和环境因素，检测初始利用FID序列对仪器系统参数进行自动校准，包括中心频率、90°脉冲和180°脉冲。信号采集参数包括重复扫描次数、等待时间、回波时间及回波个数。其中等待时间无显著影响，回波个数根据实际样品保证信号量完全衰减即可，因此主要对回波时间及重复扫描次数进行优化。

2.1.1 回波时间

回波时间的变化会影响CPMG回波曲线的衰减程度和弛豫区间。一般来讲，为减小分子扩散作用的影响，回波时间应尽量短，但对于干燥样品，回波时间的变化主要影响分布的短弛豫组分。图1A中和分别为肉中强结合水、部分烘干未去除的弱结合水，峰为脂肪峰。峰随着回波时间的延长逐渐减小且向右移动，峰占比较小，随回波时间延长逐渐消失。这是因为回波时间的改变会影响分子自扩散以及分子交换对弛豫特性的影响，回波时间越长，分子自扩散作用越强，从而导致横向弛豫时间的延长。油脂的自扩散作用比水分弱，因此在0.35 ms内，回波时间的变化并不会对脂肪弛豫时间和峰面积产生显著影响。如图1B所示，随着回波时间的延长，弛豫区间逐渐增大，同时衰减曲线的最终信号幅值减小，王志永等的研究也证实了这一点。本研究中回波时间为0.1 ms时，样品的信号幅值衰减至177.76，回波时间为0.35 ms时，样品的信号幅值衰减至57.44。回波时间为0.3 ms之后最终信号衰减幅值不再发生显著变化，并且峰面积稳定性较好，RSD为1.14%，因此选择回波时间为0.3 ms。

图1 回波时间对T2（A）和CPMG回波衰减曲线（B）的影响Fig.1 Effect of echo time on T2 (A) and CPMG echo decay curves (B)

2.1.2 重复扫描次数

重复扫描次数对样品的有直接的影响，重复扫描次数越多，越高。如图2A所示，弛豫时间在20 ms后开始出现脂肪峰，重复扫描次数与脂肪峰面积之间存在良好的线性关系（=153.42+0.469 4），为1.000。随重复扫描次数增加，由最初的49.91增加至180.97（图2B）。本研究中，虽然重复扫描128 次会显著提高，但扫描次数过多会导致磁体发热，引起样品温度升高，从而改变弛豫特性，并且花费更长的检测时间。因此，本研究选择重复扫描次数64 次，此时稳定的弛豫特性能够满足测定样品的需求，脂肪峰面积RSD仅为0.28%。

图2 重复扫描次数对T2（A）和RSN（B）的影响Fig.2 Effect of number of scanning cycles on T2 (A) and signal-to-noise ratio (RSN) (B)

2.2 样品参数的优化

2.2.1 样品质量

不同质量样品对脂肪弛豫特性有显著影响，结果见表1，其中为脂肪峰面积，是样品中脂肪的弛豫时间。随样品质量的增大呈线性增加，相关系数可达0.999 2。随着样品质量增加也会发生后移，并且样品质量越大，的稳定性越好（RSD越小）。当样品质量为4.055～5.017 g时，各项弛豫特性均呈现较好的稳定性，同时也显著高于低质量样品，此结果与Keeton等研究结论一致，因此，本研究脂肪含量测定选择猪肉样品质量为4 g。

表1 样品质量对RSN及脂肪弛豫特性的影响Table 1 Effect of sample mass on RSN and relaxation characteristics of fat

2.2.2 烘干时间

为消除水分信号的干扰，本研究对猪肉样品进行烘干处理。烘干时间长短直接影响脂肪测定时间效率，同时烘干时间也显著影响样品弛豫特性。从图3可以看出，鲜肉样品（烘干0 h）中存在3 个弛豫峰，其中为结合水，为不易流动水和脂肪，为自由水。烘干2 h后，由开始的3 个弛豫峰减少为2 个，这可能是因为温度升高使肌原纤维蛋白变性，破坏了水与蛋白质间的氢键及蛋白凝胶网状结构，结合水的流动性变强，而具有较高自由度的不易流动水从凝胶体系中脱离出来形成自由水，导致水分蒸发，即自由水消失，此时的2 个峰分别表示未烘干的水分（′）和脂肪（′）。姜秀丽等研究也发现，当烘干一定时间后，不易流动水峰面积显著降低，同时分裂出一个与水分变化关系并不明显的峰，即为脂肪峰。当样品烘干4 h后脂肪峰（′）面积不再发生显著变化。继续烘干到6 h，′峰面积占比达52.18%，此时峰面积稳定性良好，RSD为3.07%。随着烘干时间继续延长，′峰又向左移动且峰面积逐渐减小，样品中的弱结合水不断减少，但脂肪峰（′）基本不变，弛豫区间在31.178～691.588 ms内。为了保证样品中脂肪和水分的充分分离，获得稳定的脂肪峰面积，本研究选择烘干6 h。

图3 烘干时间对T2谱图的影响Fig.3 Effect of drying time on T2 relaxation spectra

2.2.3 样品检测温度

从图4可以看出，随着温度的升高，脂肪弛豫时间逐渐后移，峰面积呈先上升后下降的趋势，在40 ℃时峰面积显著高于其他温度。脂肪弛豫时间延后主要是由于温度的升高使样品内部油脂的热运动性加强导致，脂肪峰面积先上升后下降主要是样品温度对分子结构和相态产生影响。陈芳宇等在巧克力熔化过程弛豫特性变化研究中也发现，随着温度的升高，液体油脂峰逐渐后移，且峰面积逐渐增大，达到一定温度后开始下降。由于猪脂肪熔点为27.5～48.4 ℃，为保证样品油脂内部状态一致，样品检测温度确定为50 ℃。

图4 样品检测温度对弛豫特性的影响Fig.4 Effect of detection temperature on relaxation characteristics

2.3 方法验证

在上述研究获得的检测参数下，即样品质量4 g、烘干时间6 h、样品检测温度50 ℃、回波时间0.3 ms、重复扫描次数64 次，对方法的重复性和精密度进行验证。

2.3.1 重复性

针对不同脂肪含量的猪肉进行低场核磁信号采集，其脂肪峰基本重合（图5），并且能够获得稳定的脂肪峰面积（，表2），多次检测结果的RSD分别为2.72%、2.44%、1.69%，说明在该检测条件下能够保证检测结果的良好重复性。

表2 样品脂肪峰面积的重复性Table 2 Repeatability RSD of peak area (Afat)

图5 重复性验证样品的弛豫谱图Fig.5 Relaxation spectra showing good repeatability of the LF-NMR method

2.3.2 精密度

如表3、4所示，日内精密度分别在一天中的早、中、晚进行验证，日间精密度分别在第1、3、5天进行实验，脂肪峰面积的日内、日间精密度RSD分别为3.07%和2.57%，说明该方法具有良好的精密度。

表3 样品脂肪峰面积的日内精密度Table 3 Intra-day precision of Afat

表4 样品脂肪峰面积的日间精密度Table 4 Inter-day precision of Afat

2.4 猪肉中脂肪含量测定

不同物种油脂中氢质子密度不同，因此不同物种油脂含量测定时，应采用相应物种纯油脂标准样品。Li Yuntong等在对燕麦中脂肪含量定量时也以燕麦中提取的脂肪作为标准样品。本方法中脂肪含量测定用纯猪油作为标准样品。如图6所示，弛豫时间1 ms出现的峰，可能是由大分子结构和与其紧密结合的质子产生，长弛豫的脂肪峰（）随着猪油质量的增加而不断增大。以猪油质量为自变量，脂肪峰面积为因变量，建立标准曲线的线性方程为=66 292-70.693（=0.999 9），结果显示，在0.011 1～0.977 2 g的范围内，猪油质量与脂肪峰面积具有很好的线性关系。

图6 不同质量猪油T2弛豫谱图Fig.6 T2 relaxation spectra for different masses of lard

根据标准曲线得到待测猪肉样品中脂肪质量，从而计算出脂肪含量。如表5所示，低场核磁法测得的脂肪含量结果具有更好的重复性。Sørland等研究发现，索氏抽提法和梯度场低场核磁法测定脂肪含量结果相关性为0.975，本研究中索氏抽提法和低场核磁法测得的结果也显著相关（＜0.05），达到0.999 5（=0.962 1+0.416 6），绝对误差在0.15%～0.39%内。本研究结果表明，低场核磁法能够实现猪肉中脂肪含量的准确测定。

表5 低场核磁法和索氏抽提法检测脂肪含量Table 5 Measured fat contents in pork by LF-NMR and Soxhlet extraction method

3 结论

使用烘干法分离猪肉中水分和脂肪的低场核磁信号，并对回波时间、重复扫描次数等信号采集参数，样品质量、烘干时间、检测温度等样品参数进行优化，确定基于LF-NMR技术的猪肉中脂肪含量测定方法，并对方法的重复性及精密度进行考察。结果表明，4 g肉糜烘干6 h后，在检测温度50 ℃、回波时间0.3 ms、重复扫描次数64 次的条件下，以纯猪油为标准样品，能够实现猪肉中脂肪含量的准确定量。该方法绿色、安全，并显著提高检测效率，在畜禽肉脂肪含量快速准确定量方面具有广阔的应用前景。