基于大豆酶解聚集体制备Pickering乳液凝胶及环境稳定性分析

敬雪莲，蔡勇建，陈碧芬，赵谋明，赵强忠

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510641）

固体颗粒不可逆地吸附在油水界面并形成具有空间位阻作用的界面层，以此类颗粒及界面层稳定的乳液为Pickering乳液。通过定向构建中等润湿性Pickering粒子、调节油相体积分数等手段可将Pickering乳液转变为具有特定功能（如活性物质输送、固体脂肪替代）的乳液凝胶。因其可调控的两亲性、绿色安全、可食性等优势，植物蛋白已成为食品级Pickering粒子的主要来源，尤其以玉米蛋白、麦醇溶蛋白、豌豆蛋白等传统植物蛋白构建Pickering粒子的研究和应用较多。但这些蛋白粒子制备的Pickering乳液在高盐和酸性体系中易失稳，这极大限制了该类蛋白粒子在真实食品体系中的应用。因此开发新型稳定的植物蛋白基Pickering粒子将有利于扩展植物蛋白基粒子在真实食品体系中的应用形式和应用范围。

大豆酶解渣是豆类产业化过程中的主要副产物，主要是大豆蛋白经酶法水解制备可溶性大豆肽时产生的不溶性聚集物，其产量高达40%。大豆酶解渣溶解性差，再加工难度大，多作为动物饲料或被丢弃；但大豆酶解渣中蛋白质含量高（80%以上），如能采用适当方式对其加以利用，将可有效解决大豆酶解渣相关的环境污染与蛋白资源浪费等问题。近期研究发现，采用特殊处理方式加工大豆酶解渣，可得到乳化性等功能特性增强的大豆酶解聚集体（insoluble soy peptide aggregate，ISPA）。然而，目前鲜有采用ISPA制备Pickering乳液凝胶的报道，更是缺乏对其环境稳定机制的探究。基于此，本研究旨在探究ISPA作为Pickering粒子的潜力，在探索ISPA质量分数和油相体积分数对Pickering乳液的粒径、显微结构、流变学性质影响基础上，进一步分析盐离子浓度和酸性pH值对ISPA基Pickering乳液凝胶稳定性的影响，为其在食品加工的应用提供更多理论支持和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆酶解渣（蛋白质量分数82.13%，干基计） 广东华肽生物科技有限公司；尼罗蓝 美国Sigma-Aldrich公司；叠氮钠、氯化钠、盐酸及氢氧化钠（均为分析纯） 广州精科化玻仪器公司；金龙鱼大豆油市售；除特别指明，本实验用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

Ultra-Turrax T25高速剪切机 德国IKA公司；AHBASIC II高压均质机 加拿大ATS公司；Mastersizer 2000激光粒度分析仪 英国Malvern公司；CX31光学显微镜 日本Olympus公司；LSM880激光共聚焦显微镜 德国Leica公司；MARS III哈克旋转流变仪 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆酶解聚集体的制备

将大豆酶解渣与去离子水以1∶10（g/mL）混合，50 ℃搅拌30 min，调pH值至10后继续搅拌30 min，然后在50 MPa下均质1 次，维持pH 10并在50 ℃搅拌90 min，冷却至室温（25 ℃）后调pH值至7，最后将分散液在4 ℃透析48 h，冻干后得ISPA（其油水三相接触角为92.5°）。

1.3.2 大豆酶解聚集体基Pickering乳液及乳液凝胶的制备

1.3.2.1 乳液的制备

将ISPA 分散在去离子水中形成不同质量分数（0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%和1.50%）的分散液，室温（25 ℃）搅拌2 h后分别加入不同体积分数（30%、40%、50%和60%）的大豆油，12 000 r/min高速剪切2 min后30 MPa均质2 次，得到一系列不同ISPA质量分数和油相体积分数的乳液。

1.3.2.2 乳液凝胶的制备

将ISPA分散在不同离子强度（0、50、100、200、500 mmol/L和1 000 mmol/L）的去离子水中形成质量分数为1.00%的分散液，室温（25 ℃）搅拌2 h后加入体积分数为60%的大豆油，12 000 r/min高速剪切2 min后30 MPa均质2 次，得到一系列不同离子强度的乳液凝胶。

将ISPA分散在去离子水中形成质量分数为1.00%的分散液，将ISPA分散液pH值分别调至2、3、4、5、6和7，室温（25 ℃）搅拌2 h后加入体积分数为60%的大豆油，12 000 r/min高速剪切2 min后30 MPa均质2 次，得到一系列不同pH值的乳液凝胶。

1.3.3 乳液及乳液凝胶粒径测定

利用激光粒度分析仪测定乳液及乳液凝胶的粒径。激光粒度分析仪的参数设定如下：分析模式为通用模式，样品折射率1.414，样品吸收率0.001，分散剂为纯净水，其折射率1.330，泵的转速2 500 r/min，测定温度25 ℃。体积平均直径（）按下式计算：

式中：n为直径为d的液滴数。

1.3.4 乳液及乳液凝胶显微结构和外观形态观察

1.3.4.1 乳液显微结构观察

采用光学显微镜观察乳液显微结构：取去离子水稀释10 倍的乳液至载玻片上，盖上盖玻片后，利用光学显微镜观察乳液的微观结构（目镜×10，物镜×40）。

1.3.4.2 乳液凝胶显微结构观察

采用激光共聚焦显微镜观察乳液凝胶显微结构：参照张会等的方法并稍作修改。将10 mg尼罗蓝（在633 nm激发）分散在10 mL无水乙醇中以制备荧光染料溶液，染料溶液与乳液凝胶按质量比1∶25进行染色，然后将染色的乳液凝胶置于载玻片上，盖上盖玻片后，利用激光共聚焦显微镜在×40物镜下观察乳液凝胶并采集图片。

1.3.4.3 乳液及乳液凝胶外观形态观察

取适量乳液及乳液凝胶于玻璃瓶中并对其进行拍照，以观察其外观分层状态。

1.3.5 乳液及乳液凝胶流变学性质测定

1.3.5.1 乳液及乳液凝胶剪切黏度测定

利用HAAKE MARS III旋转流变仪对乳液及乳液凝胶进行剪切黏度测定，测定条件为：C60/1° TiL锥板转子（直径60 mm，间隙52 μm），温度25 ℃，记录剪切速率1～100 s范围内乳液及乳液凝胶黏度变化。

1.3.5.2 乳液及乳液凝胶动态频率扫描测定

参考Cai Yongjian等的方法并稍作修改。用配备P60 TiL平板转子（直径60 mm，间隙1 mm）的HAAKE MARS III旋转流变仪对乳液及乳液凝胶进行频率扫描，测定温度为25 ℃。首先测定乳液及乳液凝胶随应变变化（0.01%～100%）的储能模量（storage modulus，′）和损耗模量（loss modulus，′′），确定乳液及乳液凝胶的线性黏弹区域。然后固定应变为0.5%（线性黏弹区域内），对乳液及乳液凝胶进行频率扫描（0.1～10 Hz）。

1.3.6 乳液凝胶稳定性测定

1.3.6.1 乳液凝胶贮藏稳定性测定

分别将不同NaCl浓度和不同酸性pH值的乳液凝胶（质量分数0.02%叠氮钠）放置在室温（25 ℃）下，测定贮藏90 d后乳液凝胶粒径，测试方法见1.3.3节。

1.3.6.2 乳液凝胶加热稳定性测定

分别将不同NaCl浓度和不同酸性pH值的乳液凝胶在90 ℃加热60 min后，冷却至室温（25 ℃），测定加热后乳液凝胶粒径，测试方法见1.3.3节。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 ISPA质量分数和油相体积分数对乳液的影响

2.1.1 乳液的粒径和显微结构

粒子质量分数和油相体积分数是影响乳液制备与粒径、流变学性质和稳定性等性质的主要因素。由表1可知，乳液的为5.59～66.81 μm。当ISPA质量分数为0.25%时，随着油相体积分数增加而增大，当ISPA质量分数为0.50%及以上时，逐渐减小。这是因为ISPA质量分数为0.25%时，不足以稳定30%及以上油相体积分数的乳液，而在ISPA质量分数为0.50%及以上时，足够的ISPA能更有效地吸附到油水界面以形成粒径较小的乳液液滴。这与Pickering粒子浓度充足时可稳定更大的油水界面，从而形成总表面积较大的小液滴的研究结果一致。另一方面，在相同油相体积分数下，均随ISPA质量分数增加而减小，这是因为较高质量分数的Pickering粒子可以稳定更大的油水界面，而在油相体积分数一定时，粒径较小的乳液液滴具有更大的总表面积。

表1 不同ISPA质量分数和油相体积分数下乳液的d4,3Table 1 d4,3 of emulsions with different ISPA mass fractions and oilphase volume fractions

由图1可知，ISPA质量分数和油相体积分数下，乳液粒径分布均呈单峰分布。当ISPA质量分数（除0.25%）一定时，乳液液滴尺寸随油相体积分数增加而减小，在油相体积分数一定时，乳液液滴尺寸随ISPA质量分数增加而减小，这与表1中乳液的变化趋势一致。另一方面，在油相体积分数为30%时，随着ISPA质量分数增加，乳液液滴不断聚集，但这种聚集现象随油相体积分数进一步增加而逐渐消失。这是因为在高ISPA质量分数和低油相体积分数的情况下，有限的油水界面上只能吸附部分ISPA，多余的ISPA分散至连续相中发生相互交联，进而引起乳液液滴聚集；当油相体积分数增加时，增加的油水界面可以吸附更多的ISPA，从而有效抑制了ISPA在连续相中的残余甚至交联现象。

图1 不同ISPA质量分数和油相体积分数下乳液的显微结构和粒径分布Fig.1 Microstructure and particle size distribution of emulsions with different ISPA mass fractions and oil-phase volume fractions

2.1.2 乳液的流动行为

乳液黏度对乳液稳定性具有重要影响，一般而言，高黏度更有利于抵抗由于重力作用产生的乳液失稳。由图2可知，本研究中乳液黏度均随着剪切速率增加而减小，呈剪切变稀特性，这是因为随着剪切速率的增加，单个液滴或液滴团簇被破坏或形变，使乳液黏度降低。另一方面，由图2也可明显看出，在相同ISPA质量分数下，乳液黏度随着油相体积分数增加而增加，且在相同油相体积分数下，乳液黏度随着ISPA质量分数增加也逐渐增加。这是因为乳液粒径随着ISPA质量分数和油相体积分数增加而减小，吸附在油滴表面的ISPA间相互作用因乳液液滴表面积增加而增强，这有利于阻碍乳液的流动，导致乳液黏度增大。

图2 不同ISPA质量分数和油相体积分数下乳液的剪切黏度Fig.2 Viscosity versus shear rate curves of emulsions with different ISPA mass fractions and oil-phase volume fractions

2.1.3 乳液的黏弹性

通过调控油相体积分数将Pickering乳液转变为乳液凝胶是构建Pickering乳液凝胶的有效手段，黏弹性是评价乳液凝胶性能的重要参数。由图3可知，在0.1～10 Hz内，本研究乳液′和″均随频率增加而略微增加且′大于″，表明所有乳液形成了以弹性主导的弱凝胶结构。一方面，在相同ISPA质量分数下，乳液′和″随着油相体积分数增加而增加，这是因为油相体积分数越高，乳液液滴间距离越小而堆积密度越大，因此乳液的凝胶强度越高。另一方面，在相同油相体积分数下，乳液′和″随着ISPA质量分数增加而增加，这一结果与蛋白颗粒稳定的Pickering乳液一致，蛋白颗粒包裹的油滴可以通过油水界面上吸附的蛋白颗粒和/或连续相中未吸附的蛋白颗粒间的相互作用而被纳入凝胶网络，蛋白颗粒浓度增加会进一步增强此相互作用，导致Pickering乳液凝胶网络结构增强。

图3 不同ISPA质量分数和油相体积分数下乳液的黏弹性Fig.3 Viscoelasticity of emulsions with different ISPA mass fractions and oil-phase volume fractions

2.1.4 乳液外观

由图4可知，当ISPA质量分数为0.25%和0.50%时，所有油相体积分数的乳液均出现分层现象，且ISPA质量分数为0.25%的乳液分层高度更高。当ISPA质量分数为0.75%及以上时，所有乳液外观均保持稳定。另一方面，当油相体积分数为30%和40%时，装在玻璃瓶中乳液的无法倒置不动，而当油相体积分数为50%和60%时，所有ISPA质量分数的乳液均可倒置保持静止，这与乳液黏弹性结果一致，当油相体积分数为50%和60%时，乳液均在100 Pa以上，这表明此时乳液凝胶强度显著增加，形成自支撑的凝胶网络结构。由此也可知乳液黏弹性主要由油相体积分数决定，在油相体积分数为30%和40%时，即使增加ISPA质量分数也无法形成自支撑的凝胶网络结构。

图4 不同ISPA质量分数和油相体积分数下乳液外观图Fig.4 Appearance of emulsions with different ISPA mass fractions and oil-phase volume fractions

由以上研究结果可知，ISPA因其接触角（92.5°）接近90°具有稳定油水界面的能力，且通过调控ISPA质量分数和油相体积分数可成功制备出具有自支撑的凝胶网络结构，在ISPA质量分数和油相体积分数分别为1.00%和60%时，即可制备出性质良好的Pickering乳液凝胶，考虑到ISPA基Pickering乳液凝胶在真实食品体系中的应用，进一步探究环境应力（离子强度、pH值）对其性质的影响。

2.2 NaCl对Pickering乳液凝胶的影响

2.2.1 不同NaCl浓度下乳液凝胶的粒径和显微结构

盐离子对乳液性质的影响会直接决定其在真实食品体系中的应用，基于此，明晰离子强度对ISPA基Pickering乳液凝胶性质的影响具有重要意义。由图5A可知，在不同NaCl浓度下，Pickering乳液凝胶的粒径分布均成单峰分布，且随着NaCl浓度增加而逐渐减小（8.86～6.83 μm），当NaCl浓度达500 mmol/L时，继续增加NaCl浓度，未发生显著变化。这表明ISPA基Pickering乳液凝胶在高NaCl浓度下仍可保持稳定，这主要是因为盐离子对ISPA产生了静电屏蔽效应，静电斥力减弱促进更多的ISPA吸附在油水界面上，增强了ISPA的乳化能力。

为探究NaCl浓度对Pickering乳液凝胶显微结构的影响，利用激光共聚焦显微镜观察ISPA在乳液凝胶中的分布情况。由图5B可知，在本研究NaCl浓度下，ISPA均可有效地吸附在油滴表面并形成界面膜和连续的网络结构，使乳液液滴仍呈紧密排列状态，这表明ISPA稳定Pickering乳液凝胶主要是空间位阻作用而非静电斥力。另一方面，激光共聚焦显微镜图中乳液液滴尺寸随着NaCl浓度增加而降低，这与乳液凝胶的变化趋势一致。这表明高盐浓度不会影响ISPA在油水界面的吸附和乳液凝胶网络的形成。

图5 不同NaCl浓度下Pickering乳液凝胶的粒径分布及d4,3（A）和显微结构（B）Fig.5 Particle size distribution,d4,3 (A) and microstructure (B) of Pickering emulsion gels under different NaCl concentrations

2.2.2 不同NaCl浓度下乳液凝胶的流变学性质

由图6A可知，乳液凝胶黏度随NaCl浓度增加而增加。这是因为在高NaCl浓度下，ISPA间的相互作用因静电斥力的屏蔽而增强，导致黏度增加；另一方面，由于乳液凝胶粒径随着NaCl浓度增加而减小，吸附在油滴表面的ISPA间相互作用因乳液液滴总表面积增大而增强，从而黏度增加。由图6B可知，在0.1～10 Hz内，不同NaCl浓度下，Pickering乳液凝胶的′和″均随频率增加而略微增加且′大于″，表明NaCl的添加不会影响ISPA基Pickering乳液凝胶以弹性主导的弱凝胶结构特性。此外，乳液凝胶的′和″随NaCl浓度增加而增加，这是因为高盐浓度下，ISPA间的静电斥力由于盐离子电荷屏蔽作用被屏蔽，这可增强吸附在油滴表面的ISPA间相互作用，促进乳液液滴间更紧密的堆积，使形成的凝胶网络结构强度增强。

图6 不同NaCl浓度下Pickering乳液凝胶的剪切黏度（A）和黏弹性（B）Fig.6 Shear viscosity (A) and viscoelasticity (B) of Pickering emulsion gels under different NaCl concentrations

2.2.3 不同NaCl浓度下乳液凝胶的贮藏稳定性和加热稳定性

由图7A可知，在不同NaCl浓度下，经贮藏或加热后的乳液凝胶均变化较小；由图7B可知，所有NaCl浓度下的Pickering乳液凝胶在经贮藏或加热后其外观均保持稳定且可倒置，这表明ISPA基Pickering乳液凝胶具有良好稳定性且NaCl的添加不会影响其稳定性。这是因为在各NaCl浓度下，ISPA仍可有效地吸附在油水界面上，形成的界面层因空间位阻作用可阻止液滴聚结，此外，在各NaCl浓度下，Pickering乳液凝胶的黏度和黏弹性均增强，这可有效阻止乳液液滴自由移动而增强其稳定性。

图7 不同NaCl浓度下Pickering乳液凝胶的贮藏稳定性和加热稳定性Fig.7 Storage and heat stability of Pickering emulsion gels under different NaCl concentrations

2.3 酸性pH值对Pickering乳液凝胶的影响

2.3.1 不同酸性pH值下乳液凝胶的粒径和显微结构

在真实食品体系中pH值也是重要参数，为进一步明晰ISPA基Pickering乳液凝胶在真实食品体系中的应用前景，探究酸性pH值下ISPA基Pickering乳液凝胶的性质。由图8A可知，在pH 2～7下，乳液凝胶在7.21～9.08 μm范围内，即使在低pH值下乳液凝胶仍较小且粒径分布仍为单峰分布。这表明酸性环境下ISPA基Pickering乳液凝胶仍可保持稳定，具有耐酸特性。

图8 不同酸性pH值下Pickering乳液凝胶的粒径分布及d4,3（A）和显微结构（B）Fig.8 Particle size distribution,d4,3 (A) and microstructure (B) of Pickering emulsion gels under different acidic pHs

为探究酸性pH值对Pickering乳液凝胶显微结构的影响，利用激光共聚焦显微镜观察ISPA在乳液凝胶中的分布情况。如图8B可知，不同pH值下，ISPA均可吸附在油滴表面并形成界面层，经乳液液滴密集堆积最终形成致密的凝胶网状结构，这是因为酸性pH值下ISPA分子羧基质子化使得静电斥力减弱，从而增强了ISPA在油滴表面的吸附，这也表明ISPA稳定Pickering乳液凝胶主要依赖于界面层的空间位阻作用而非静电斥力作用。

2.3.2 不同酸性pH值下乳液凝胶的流变学性质

由图9A可知，与pH 7相比，所有酸性pH值下的乳液凝胶黏度均增加。这是因为在酸性pH值下，静电斥力由于部分ISPA分子羧基质子化减弱，使得ISPA在油水界面的吸附增强同时其在油水界面的交联也增强，这些都可导致乳液凝胶黏度增加。如图9B所示，在0.1～10 Hz内，不同pH值下的Pickering乳液凝胶的′和″均随频率增加而略微增加，且′大于″，表明酸性pH值不会影响ISPA基Pickering乳液凝胶以弹性主导的弱凝胶结构特性。另一方面，与pH 7相比，酸性pH值下Pickering乳液凝胶的′和″均增大，这主要是因为酸性pH值下ISPA间的静电斥力减弱，降低了ISPA向油水界面吸附的阻力同时增强了吸附在油滴表面的ISPA间相互作用，促进更致密的凝胶网络结构形成。

图9 不同酸性pH值下Pickering乳液凝胶的剪切黏度（A）和黏弹性（B）Fig.9 Shear viscosity (A) and viscoelasticity (B) of Pickering emulsion gels under different acidic pHs

2.3.3 不同酸性pH值下乳液凝胶的贮藏稳定性和加热稳定性

由图10A可知，不同pH值下的Pickering乳液凝胶在贮藏或加热后乳液凝胶变化较小。由图10B可知，所有pH值下的Pickering乳液凝胶在经贮藏或加热后，其外观仍保持稳定且仍可倒置。这表明酸性pH值不会影响ISPA基Pickering乳液凝胶的贮藏稳定性和加热稳定性，这是因为ISPA基Pickering乳液凝胶在酸性pH值下具有更高的黏度和更强的凝胶强度，这可有效阻止乳液液滴自由移动和聚结，因此乳液凝胶在酸性pH值下具有高稳定性。

图10 不同酸性pH值下Pickering乳液凝胶的贮藏稳定性和加热稳定性Fig.10 Storage and heat stability of Pickering emulsion gels under different acidic pHs

通过探究NaCl浓度和酸性pH值对ISPA基Pickering乳液凝胶性质的影响，发现ISPA基Pickering乳液凝胶在高盐或低pH值下仍可形成更致密的凝胶网络结构，这也进一步表明ISPA不可逆地吸附在油水界面，形成的界面层产生的空间位阻作用是其稳定Pickering乳液凝胶的主要机制。因此，即使在高盐或低pH值下，ISPA基Pickering凝胶仍具有高贮藏稳定性和加热稳定性。这一研究明晰了ISPA基Pickering乳液凝胶在高盐或低pH值下具有高稳定性的机理，为ISPA基Pickering乳液凝胶在食品加工中的应用提供参考。

2.4 ISPA基Pickering乳液凝胶稳定机理分析

由图11可知，ISPA作为Pickering粒子吸附在油滴表面形成界面层以稳定乳液，而通过调控油相体积分数可将Pickering乳液转变为乳液凝胶，在低油相体积分数下，乳液液滴因吸附在表面的ISPA分子间静电斥力而呈分散状态；当增加油相体积分数增加至50%和60%时且ISPA质量分数充足时，油水界面因油相体积分数增加而增加，使更多的ISPA吸附在油滴表面形成更小的乳液液滴，同时，乳液液滴间距离因油相体积分数增加而减小，使乳液液滴密集堆积形成凝胶网络结构，成功制备出具有自支撑结构的Pickering乳液凝胶。

图11 ISPA基Pickering乳液凝胶形成和在盐离子及酸性pH值下的稳定机理Fig.11 Formation mechanisms of ISPA-based Pickering emulsion gels and stability mechanisms at salt ions and acidic pH

结合NaCl和酸性pH值对ISPA基Pickering乳液凝胶性质的影响，可知盐离子对ISPA产生的静电屏蔽作用和酸性pH值下ISPA分子羧基质子化后静电斥力减弱可降低ISPA向油水界面吸附的阻力，形成粒径更小的乳液液滴；另一方面，吸附在油水界面的ISPA间相互作用也因静电斥力的减弱而增强，导致ISPA相互交联形成更致密的凝胶网络结构，而Pickering乳液凝胶网络结构的增强可有效阻止液滴自由移动，这是其在高盐和低pH值条件下具有高稳定性的主要原因，这也表明ISPA主要依靠形成的界面层产生的空间位阻作用而非静电斥力维持Pickering乳液凝胶稳定性。

3 结论

通过对大豆酶解渣进行适当处理得到ISPA，成功制备出一系列含不同ISPA质量分数和油相体积分数的Pickering乳液，并对比分析了Pickering乳液凝胶在特定环境下的流变学性质与稳定性能，发现ISPA基Pickering乳液的流变学特性主要由油相体积分数决定，尤其在50%和60%油相体积分数下制备的Pickering乳液具有明显的凝胶特性；ISPA基Pickering乳液凝胶黏弹性随着NaCl浓度增加而增强，且与中性pH值相比，酸性pH值下的乳液凝胶黏弹性更强。需特别指出的是，制备的ISPA基Pickering乳液凝胶在高盐或低pH值下仍具有高贮藏稳定性和加热稳定性，这表明ISPA及其稳定的Pickering乳液凝胶在蛋白精深加工及新型乳制品研发中具有巨大的加工潜力与应用前景。