高黎贡山紫果西番莲果皮中原花青素的提取工艺及其稳定性

张星和，侯洪波，邹章玉，冯李院，汪玉洁*

（1.保山学院资源环境学院，云南 保山 678000；2.云南省高校怒江河谷生物质资源高值转化与利用重点实验室，云南 保山 678000）

西番莲（Passiflora edulis）别名受难果、热情果、洋酸茄花，是一种具有浓郁芳香气味的水果[1-3]，为多年生的常绿西番莲科西番莲属双子叶植物，原产于南美巴西，目前在世界范围内广泛种植，国内主要集中于四川、广西和云南等地，是近年来南方地区重点开发的特色经济作物之一[4-7]。西番莲果实不仅可供食用，鲜果还可用于果汁、果酒和果脯的生产。西番莲属果实和根叶作为药物的应用历史悠久，国外主要用来治疗焦虑、痢疾、高血压、疝气等[8]。DeQueiroz等[9]用西番莲果皮粉治疗2型糖尿病；Do Socorro等[10]用西番莲果皮粉治疗艾滋病患者的脂代谢障碍问题，结果表明在调整饮食结构的同时，食用西番莲果皮粉90 d能改善总胆固醇构成，同时降低甘油酯的浓度；Ayres等[11]证明西番莲叶提取物具有抗焦虑活性。我国《云南民族药大辞典》中记载，西番莲全身可入药，具有活血镇痛、止咳化痰的功效，可用于治疗感冒、失眠和神经痛等[12-13]。因此，西番莲作为药食同源的植物具有极大的开发价值和市场前景。

西番莲的药用价值很高，根本原因是其含有丰富的功能性物质。目前，对西番莲功能成分的研究主要集中在对果皮中多酚类[14-16]、膳食纤维[17]、果胶多糖[18-19]、生物碱[20-21]和类胡萝卜素、芳香类物质[2,22]的提取优化及性质的研究。其中，关于黄酮类[23-24]活性物质的研究最多，如García-Ruiz等[25]利用高效液相色谱法从香蕉西番莲中分离鉴定出9种原花青素。研究表明，原花青素是由儿茶素或表儿茶素聚合而成的黄酮类天然高分子物质，具有多种药理活性[26-27]，如抗氧化[28]、抗菌[29]、抗癌[30]、抗动脉粥样硬化[31]、抗炎等[32]。研究显示，低聚原花青素（oligomeric proanthocyanidis，OPC’s）在体内的抗氧化活性是VC的20倍、VE的50倍[33]，其因超强的抗氧化性已成为食品、医药和化妆品等领域的研究热点。王开银[34]采用超声辅助和溶剂萃取法提取巴西莓原花青素，提取率为2.0278%；只德贤等[35]采用单因素试验结合响应面法对微波-超声协同提取原花青素的工艺进行优化，白刺果原花青素最大得率为（17.289±0.402）mg/g。但是目前对紫果西番莲果皮中原花青素的提取工艺及稳定性研究较少。因此，本文以高黎贡山紫果西番莲果皮为原料，采用微波辅助法提取原花青素，通过单因素、响应面分析优化其提取工艺，并考察温度、光照条件和食品添加剂种类（蔗糖、柠檬酸、维生素C等）对提取液稳定性的影响。以期提高西番莲副产物的利用率，为西番莲在食品工业中的开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜紫果西番莲：采自高黎贡山地区。选择成熟度适中、形状饱满的紫果西番莲果实，去除霉变、病虫害部分和果肉，留下果皮，用去离子水洗净，通风处阴干，用高速万能粉碎机进行粉碎，过60目筛，密封放于干燥处保存备用。

儿茶素标准品（色谱纯）：中国食品药品检定研究院；香草醛：天津市光复精细化工研究所；浓盐酸：重庆川东化工集团有限公司；无水乙醇：四川陇西科学有限公司；维生素C：成都锦华药业有限责任公司；以上化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计（UV-2600）：岛津仪器苏州有限公司；微波炉（M1-211A）：广东美的厨房电器制造有限公司；旋转蒸发仪（OSB-2000）：上海爱朗仪器有限公司；60目标准筛：绍兴市上虞华丰五金仪器有限公司；高速万能粉碎机（DFT-250A）：温岭市林大机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波辅助提取原花青素

准确称取西番莲果皮粉1.0 g于锥形瓶中，按照一定的料液比加入一定浓度的乙醇溶液，充分搅拌并确保溶剂完全淹没样品，加塞封口，浸泡1 h。将混合物放入微波炉，设定微波功率，提取一段时间后，抽滤得原花青素粗提液[36]。将滤液浓缩至无醇味，加盐酸香草醛显色，于500 nm测定吸光度，计算原花青素得率。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 乙醇浓度对原花青素得率的影响

准确称取5份西番莲果皮粉1.0 g，分别加入30 mL浓度为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，固定微波功率420 W、微波时间40 s，考察乙醇浓度对原花青素得率的影响。每个水平均做3个平行。

1.3.2.2 料液比对原花青素得率的影响

准确称取5份西番莲果皮粉1.0 g，分别按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）加入浓度为 70%的乙醇溶液，固定微波功率420 W、微波时间40 s，考察料液比对原花青素得率的影响。每个水平均做3个平行。

1.3.2.3 微波功率对原花青素得率的影响

准确称取5份西番莲果皮粉1.0 g，加入30 mL浓度为 70%的乙醇溶液，微波功率为 140、280、420、560、700 W，微波时间40 s，考察微波功率对原花青素得率的影响。每个水平均做3个平行。

1.3.2.4 微波时间对原花青素得率的影响

准确称取5份西番莲果皮粉1.0 g，固定料液比1∶30（g/mL），乙醇浓度 70%，微波功率 420 W，考察微波时间 20、40、60、80、100 s对原花青素得率的影响。每个水平均做3个平行。

1.3.3 响应面设计优化试验

根据Box-Behnken设计原理，以原花青素得率（Y）为响应值，选取乙醇浓度（X1）、料液比（X2）、微波功率（X3）和微波时间（X4）为变量进行四因素三水平的响应面优化，具体因素水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4 稳定性试验

将原花青素提取液进行适当稀释后用于研究西番莲果皮原花青素在不同光照条件、不同温度和不同添加剂种类下的稳定性。

1.3.4.1 光照条件对原花青素稳定性的影响

将3份原花青素提取液分别置于室外阳光直射、室内自然光和避光（用锡箔纸包裹置于暗处）条件下，每隔 2 h（2、4、6、8、10 h）于 500 nm 处测定吸光度 Ai，相同体积未置于光照条件下的原花青素原液吸光度记为A0，以Ai/A0的变化评价原花青素保存率，分析光照条件对西番莲果皮原花青素稳定性的影响。

1.3.4.2 温度对原花青素稳定性的影响

将 5 份原花青素提取液分别于 0、20、40、60、80 ℃下保温 2、4、6、8、10 h，冷却至室温后于 500 nm 测定吸光度Ai，相同体积未保温处理的原花青素原液吸光度记为A0，以Ai/A0的变化评价原花青素保存率，分析温度对西番莲果皮原花青素稳定性的影响。

1.3.4.3 不同食品添加剂对原花青素稳定性的影响

用相同浓度的蔗糖、柠檬酸、VC、山梨酸钾溶液稀释提取的原花青素，摇匀后避光且于室温下保存0、12、24 h测吸光度Ai，加入相同体积的超纯水作为对照（A0），以Ai/A0的变化评价原花青素保存率，分析常用食品添加剂对西番莲果皮原花青素稳定性的影响。

1.3.5 指标检测方法

采用香草醛-浓盐酸法测定提取液中原花青素含量：以乙醇溶液溶解儿茶素标准品，加入4%的香草醛和浓盐酸，30℃水浴避光反应10 min，在最大吸收波长500 nm处测定吸光度。以儿茶素浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标作图绘制标准曲线，得到回归方程 y=1.935 1x+0.003 6，R2=0.999 4。

由标准曲线计算提取液中原花青素的浓度（mg/mL），按下式计算原花青素得率。

1.4 数据分析

用OriginPro9.0和SPSS 22.0进行绘图及数据统计分析，Design-Expert V8.0.6进行响应面设计试验和方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对原花青素得率的影响

图1为乙醇浓度对西番莲果皮原花青素得率的影响。

图1 乙醇浓度对西番莲果皮原花青素得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on proanthocyanidins yield

由图1可知，原花青素得率随着乙醇浓度的增加呈先上升后下降的变化趋势，且整体上差异显著。当乙醇浓度为60%时，西番莲果皮原花青素得率达到了最大值，为5.33%，差异显著（P＜0.05）。原因可能是乙醇浓度过低时，原料与体系之间渗透压小，西番莲果皮未能充分浸润，不利于原花青素的溶出；随着乙醇浓度的增大，醇水比发生改变，溶液体系介电常数改变，根据相似相溶原理，有利于多酚类物质的溶解；当乙醇浓度为60%时，乙醇对粉末中氢键的破坏达最大，再继续增大乙醇浓度脂溶性杂质的溶出量也有所增加，成为原花青素的竞争性抑制剂[37]，导致得率下降。因此，选择乙醇浓度50%、60%和70%进行后续试验。

2.1.2 料液比对原花青素得率的影响

图2为料液比对西番莲果皮原花青素得率的影响。

图2 料液比对西番莲果皮原花青素得率的影响Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on proanthocyanidins yield

由图2可知，原花青素得率随溶剂体积的增大而增大，然后有所降低，之后趋于平稳。料液比从1∶10（g/mL）变化到1∶30（g/mL），得率显著性上升，可能是由于溶剂体积的增加，使原料更好地分散和漂浮，增大了原花青素与溶剂的接触比表面积，传质推动力增大，从而提高了得率；而料液比为 1∶40、1∶50（g/mL）时，虽与1∶30（g/mL）时的得率相比差异显著，但与 1∶20（g/mL）的得率比较并不显著。可能是料液比为1∶30（g/mL）时，原花青素的析出已接近平衡。再继续增大溶剂体积，会使其他成分加速溶出并影响原花青素的稳定性，得率下降。综合考虑，选择料液比 1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）进行后续试验。

2.1.3 微波功率对原花青素得率的影响

图3为微波功率对西番莲果皮原花青素得率的影响。

图3 微波功率对西番莲果皮原花青素得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on proanthocyanidins yield

由图3可知，原花青素得率随着微波功率的增大先升高后下降，整体上差异显著。其中，当微波功率达到420 W时，得率最高，为5.24%，具有显著性差异（P＜0.05）。这可能是由于微波功率增大，溶剂单位时间吸收的微波能越多，更多的微波能转化为热能，使体系温度升高，分子扩散加快，原花青素的溶解度随之增大；但当微波功率过大，热效应使体系温度过高，原花青素被氧化或分解，得率下降。因此，选择微波功率280、420、560 W进行后续试验。

2.1.4 微波时间对原花青素得率的影响

图4为微波时间对西番莲果皮原花青素得率的影响。

图4 微波时间对西番莲果皮原花青素得率的影响Fig.4 Effect of microwave time on proanthocyanidins yield

由图4可知，原花青素得率随着微波时间的延长呈先上升后下降的趋势，且整体上差异显著。当微波时间为80 s时，得率最大且差异显著（P＜0.05）。微波时间超过80 s后，原花青素得率下降。这可能是因为较长的微波时间，使更多的西番莲果皮细胞壁结构改变，便于内部的原花青素扩散到溶液，所以得率增加；而继续延长微波时间，溶液中极性物质吸收的过多热量会破坏已提取的原花青素，得率反而下降。因此，选择微波时间60、80、100 s进行后续试验。

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 数学模型的建立及方差分析

响应面优化试验结果见表2。

表2 响应面试验结果Table 2 Results of response surface methodology

用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行回归拟合，得到乙醇浓度（X1）、料液比（X2）、微波功率（X3）和微波时间（X4）与西番莲果皮原花青素得率（Y）的多项式模型：Y=5.31-0.22X1+0.19X2+0.39X3+0.18X4+0.29X1X2+0.21X1X3+0.038X1X4-0.15X2X3-0.28X2X4-0.15X3X4-0.42X12-0.38X22-0.42X32-0.58X42。所得模型的方差分析结果见表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3可知，响应面模型高度显著（P＜0.000 1）；失拟项不显著（P=0.857 4＞0.05），且决定系数 R2=0.945 0，校正系数R2adj=0.889 9，表明该模型与试验的拟合效果较好，有一定的准确性；自变量与响应值之间关系显著，能很好地预测原花青素的提取工艺参数；变异系数为3.95%，信噪比为13.301，表明该模型试验误差小且可靠性高。

由F值大小可知，影响原花青素得率的因素主次顺序为微波功率（X3）＞乙醇浓度（X1）＞料液比（X2）＞微波时间（X4），其中微波功率影响高度显著（P＜0.000 1），其他 3 个因素影响极显著（P＜0.01）；二次项中 X12、X22、X32和 X42影响高度显著（P＜0.000 1），X1X2、X2X4影响极显著（P＜0.01），X1X3影响显著（P＜0.05），说明因素对响应值的影响并非简单的线性关系。

2.2.2 响应面图与交互作用分析

图5～图7为所建模型的等高线和响应面曲面图。

图5 乙醇浓度和料液比对原花青素得率影响的等高线和响应面曲面Fig.5 Contour lines and response surface for the effect of ethanol concentration and material-to-liquid ratio on proanthocyanidins yield

图6 料液比和微波时间对原花青素得率影响的等高线和响应面曲面Fig.6 Contour lines and response surface for the effect of material-to-liquid ratio and microwave time on proanthocyanidins yield

图7 乙醇浓度和微波功率对原花青素得率影响的等高线和响应面曲面Fig.7 Contour lines and response surface for the effect of ethanol concentration and microwave power on proanthocyanidins yield

响应面曲面图的陡峭程度能够反映两两因素对原花青素得率影响的强弱，坡面越陡峭，则原花青素得率受交互作用影响越大；坡面越平缓，原花青素得率受交互作用影响越小。等高线形状也可反映交互作用的强弱，椭圆形表示相应因素之间交互作用显著，圆形表明交互作用不显著。由图5～图7可知，响应面曲面的陡峭度大小顺序为X1X2＞X2X4＞X1X3，且等高线均呈椭圆形，表明乙醇浓度和料液比、料液比和微波时间、乙醇浓度和微波功率的交互作用对原花青素得率影响显著，与表3方差分析结果一致。

2.2.3 最优工艺和验证试验

西番莲原花青素提取的最优工艺条件为乙醇浓度58.71%，料液比 1∶30.98（g/mL）、微波功率 474.84 W、微波时间81.56 s，此条件下西番莲果皮原花青素得率预测值为5.41%。根据实际操作条件，将最佳提取工艺修正为乙醇浓度59%，料液比为1∶31（g/mL）、微波功率为470 W、微波时间82 s，得到原花青素得率为5.38%。实际值与预测值之间偏差较小，验证了该响应面模型的有效性，说明试验优化的技术参数是可靠的。

2.3 西番莲原花青素稳定性结果分析

2.3.1 光照条件对原花青素稳定性的影响

图8为不同光照条件对原花青素稳定性的影响。

图8 光照条件对原花青素稳定性的影响Fig.8 Effect of light condition on the stability of proanthocyanidins

由图8可知，在不同光照条件下，原花青素提取液的吸光度比值都随着时间的延长而减小，且避光组＞自然光组＞阳光直射组。在10 h内避光组的吸光度比值呈较缓慢下降趋势，自然光组与阳光直射组在2 h～8 h时吸光度比值都明显降低，相同时间内阳光直射组下降更快；在8 h～10 h时自然光组吸光度比值减小速度迅速提升，阳光直射组趋于平稳，这可能是因为阳光直射8 h时，在强紫外线作用下，溶液中的原花青素含量太低，大量原花青素均已被破坏，导致吸光度比值变化不明显。表明避光保存有利于西番莲原花青素浓度的稳定，减少降解损失。因此在使用西番莲原花青素时尽量避光，尤其避免紫外线照射。

2.3.2 温度对原花青素稳定性的影响

图9为不同温度对原花青素稳定性的影响。

图9 温度对原花青素稳定性的影响Fig.9 Effect of temperature on the stability of proanthocyanidins

由图9可知，温度影响西番莲原花青素稳定性，随着时间的延长，各温度下的原花青素吸光度比值均有不同程度的降低。温度低于60℃时，西番莲原花青素的吸光度比值在10 h内变化较小，基本稳定；当温度为60℃时，吸光度比值随着时间延长急剧下降。故加工提取原花青素时，温度以不高于60℃为佳，应在低温下保存。

2.3.3 食品添加剂种类对原花青素稳定性的影响

图10为食品添加剂种类对原花青素稳定性的影响。

图10 食品添加剂种类对原花青素稳定性的影响Fig.10 Effect of food additive type on the stability of proanthocyanidins

由图10可知，在避光且低温条件下，添加蔗糖、柠檬酸、VC和山梨酸钾的原花青素提取液的吸光度比值很接近，说明这4种添加剂对西番莲果皮原花青素的稳定性无明显影响。即使添加后24 h，蔗糖和山梨酸钾的原花青素混合液吸光度比值也没有太大的变化。而一段时间后，柠檬酸和VC对原花青素稳定性的影响较为明显，溶液的吸光度比值有所增大，可能是酸性条件下原花青素会部分水解形成花青素和花色苷，VC作为典型的抗氧化剂，也会促进原花青素转化。因此蔗糖、山梨酸钾对原花青素的稳定性无明显影响，而柠檬酸和VC会使原花青素水解，有一定程度的增色作用。

3 结论

本文以高黎贡山紫果西番莲果皮为原料，优化了微波辅助提取原花青素的工艺条件，并对提取液的稳定性进行了研究。通过Box-Behnken响应面分析法得到最佳提取条件为乙醇浓度59%，料液比为1∶31（g/mL）、微波功率为470 W、微波时间82 s，在此工艺下原花青素得率为5.38%；影响原花青素得率的因素顺序为微波功率＞乙醇浓度＞料液比＞微波时间。稳定性试验结果表明：原花青素在光照尤其是阳光直射下稳定性较差，避光条件下较稳定，因此在贮存或使用时应尽量避免暴露在紫外线下；其热稳定性较差，在60℃以上容易分解，因此应尽量避免高温；添加剂蔗糖、苯甲酸钠对其稳定性无明显影响，而柠檬酸和VC对其有一定的增色作用。试验结果为原花青素的提取以及应用开发提供了依据。