芦荟苷通过调控JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB信号通路改善大鼠脑缺血再灌注损伤

蔡亮，张炳东

（广西医科大学第一附属医院麻醉科，广西 南宁 530021）

0 引言

脑卒中已经成为威胁人类生命健康的第二大疾病，每年约有1500万新发病例[1,2]。病理学将脑卒中分为两大类：缺血性脑卒中（Cerebral Ischemic Stroke，CIS）和出血性脑卒中，其中约85%脑卒中病例属于缺血性脑卒中。CIS诱因是大脑供血的主要血管栓塞或则体循环功能障碍导致脑组织供血不足。CIS损伤机制为缺血缺氧导致细胞外微环境改变和小胶质等免疫细胞在缺血区被激活释放炎症因子[3,4]。与此同时，无氧代谢促使活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）等自由基水平升高[5]。目前，急性缺血性脑卒中的首选治疗方式是通过静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂（Recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）重建血运。虽然恢复缺血器官的血流对防止组织出现不可逆损伤至关重要，但再灌注本身也可能会导致器官损伤。CIRI并不单独发生于缺血性脑卒中术后，首先颅内肿瘤和血肿会压迫病变区域的血管和增加颅内压，上诉原因会导致局部脑组织出现缺血、缺氧、水肿、坏死等诸多病理改变[5-7]；其次失血性休克和术中心律失常、心脏骤停都会导致体循环功能障碍、血容量不足和血流动力学障碍从而引起脑组织缺血缺氧[8,9]；最后我们发现心肺转流术（Cardiopulmonary bypass，CPB）治疗过程中的持续性低血压或手术操作也会导致CIRI[10,11]。 JAK1/STAT1信号通路作为一种重要的细胞内信号转导途径。研究发现JAK/STAT信号通路不仅与造血、炎症和免疫相关疾病有着密切联系，还与细胞生长、增殖和分化有关[12,13]。TLR4/NF-κB信号通路在免疫中起着关键作用。研究发现TLR4/NF-κB信号通路激活后不仅能促进星形胶质细胞、小胶质细胞活化并释放炎症介质，还会激活金属蛋白途径损伤血脑屏障[14-16]。现发现TLR4/NF-κB与JAK/STAT信号通路之间存在串扰，且JAK1/STAT1信号通路参与调控TLR4信号通路转导的炎症反应[17-19]。

越来越多的天然植物提取物如姜黄素、儿茶素被应用于医疗领域，从天然植物中获得外源性抗氧化剂已经被作为减轻疾病氧化损伤的重要新策略。芦荟苷作为芦荟的天然提取物，属于天然酪氨酸酶抑制剂，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、等多种生物活性[20,21]。芦荟苷的脑保护作用已有一定前期研究，基础研究发现芦荟苷具有减轻神经系统疾病脑水肿、血脑屏障破坏、神经炎症、神经元凋亡、氧化应激和改善认知功能障碍的作用[22,23]。鉴此，本实验拟从信号通路、细胞凋亡、炎症方面探索芦荟苷改善脑缺血再灌注损伤中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药品和试剂

芦荟苷（selleck公司），白介素10(IL-10)ELISA试剂盒（武汉华美公司），肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒（武汉华美公司），苏木素伊红(HE)染色试剂盒（索莱宝公司），TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKara公司），PrimeScript™ RT Master Mix（TaKara公司），TB Green® Premix Ex Taq™ II Tli RNaseH Plus（TaKara公司）, JAK1抗体（abcam公司），STAT1抗体（CST公司），p-STAT1抗体（abcam公司），TLR4抗体（abcam公司）, NF-kB抗体（abcam公司），p-NF-kB抗体（abcam公司），Caspase-3抗体（abcam公司），Bcl-2抗体（abcam公司），GAPDH抗体（abcam公司），β-actin抗体（BIOSS公司）。

1.1.2 实验动物

健康雄性SD大鼠75只，体重250g～280g，SPF级，购自于广西医科大学实验动物中心。动物合格证号：SCXK（桂）2014-0002，实验动物使用许可证号：SCXK（桂）2014-0003。本实验符合广西医科大学动物实验伦理要求。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及处理

75只SD雄性大鼠随机分为对照组（C组，n=25）、模型组（M组，n=25）和治疗组（A组，n=25）。A组和M组参照杨丽[24]等人实验采用线栓法构建大鼠脑缺血再灌注损伤（Middle cerebral artery occlusion and reperfusion，MCAO/R）模型，C组只结扎对应的血管，A组再灌注时腹腔注射50mg/Kg芦荟苷进行治疗。大鼠脑缺血再灌注24小时后及时取材并保存。

1.2.2 longa神经功能评分

参照zea-longa神经行为学评分标准对再灌注24h大鼠进行评分。具体标准为无神经功能缺损为0分；患侧前爪不能完全伸展为1分；行走时向患侧转圈为2分；行走时身体向患侧倾倒为3分；不能自发行走并丧失意识为4分。

1.2.3 脑梗死面积测定

缺血再灌注24h后取出整个脑组织置于负20℃冰箱冷冻20分钟，然后将脑组织切分为5-6片，厚度为2mm。将切好的大鼠脑片放入1% TTC溶液中，37 ℃避光染色30分钟，染色结束后观察并拍照记录，采用image J软件测算梗死面积。

1.2.4 苏木素-伊红染色

对缺血再灌注24h的大鼠脑组织进行灌注固定，将灌注固定好的脑组织进行包埋切片，取石蜡切片进行二甲苯脱蜡、梯度酒精水化（100%→95%→90%→80%→70%→50%）后进行苏木素和伊红染色，脱水透明处理后封片观察。

1.2.5 脑组织炎症检测

采用大鼠酶联免疫吸附测定试剂盒检测缺血再灌注24h各组脑组织IL-10和TNF-α的变化。

1.2.6 qPCR检测JAK1、STAT1、TLR4和NF-κB转录水平

采用TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit（9767）提取总RNA后再使用PrimeScript™ RT Master Mix（036A）进行逆转录得到cDNA，最后使用PrimeScript™ RT Master Mix（820A）进行PCR扩增实验。最后以GAPDH基因作为内参基因并根据2-ΔΔCt公式计算目的基因相对表达量。本实验引物序列如下：

表1 引物序列

1.2.7 采用Western blot实验检测信号通路及凋亡相关蛋白表达

使用预冷PBS缓冲液洗去海马组织血渍，并使用蛋白裂解工作液（RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂，100∶1∶1）裂解海马组织获得蛋白上清液。向上清液中加入5×上样缓冲液后100℃水浴变性。SDS-PAGE电泳使蛋白分离。200 mA 90-120 min（根据分子量大小）将蛋白转移到PVDF膜上，5%BSA封闭2h，封闭后的条带放入一抗工作液4℃过夜，TBST缓冲液洗去多余一抗后放入荧光二抗工作液避光孵育2h后显影，最后采用image J软件对蛋白条带进行灰度值分析。

1.2.8 统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 longa神经功能评分

根据longa神经行为学评分标准评定三组大鼠脑缺血再灌注24h后的神经功能。C组未见神经功能障碍；与C组比较，M组和A组大鼠神经功能受损严重（P＜0.01）；与M组比较，A组大鼠神经功能受损减轻（P＜0.01）。

图1 三组大鼠Longa评分的比较（n=25）

2.2 各组大鼠脑梗死面积比较

M组与A组大鼠脑缺血再灌注24h后出现不同面积的梗死灶，C组未见梗死灶。使用image j软件测定三组脑组织梗死面积并计算梗死面积百分比。我们发现与C组比较，M组与A组脑组织梗死面积百分比明显增大（P＜0.05）；而与M组比较，A组脑组织梗死面积百分比显著减少（P＜0.05）。

图2 三组大鼠脑组织TTC染色结果（n=5）

图3 三组大鼠脑组织梗死面积百分比的比较

2.3 各组脑组织病理损伤情况比较

病理显微镜观察各组大鼠海马组织损伤情况，如下图所示C组海马组织细胞排列有序、层次分明，结构清晰完整，核仁明显和基质清晰均匀；与C组比较，M组海马神经元数量减少且排列不规整，并出现细胞核固缩、染色加深和弥漫空泡样变性。通过观察A组海马组织，我们发现注射芦荟苷药液能改善海马组织损伤情况。

图4 各组大鼠海马组织病理学改变（n=5，放大倍数40×，100×）

2.4 各组脑组织IL-10、TNF-α含量比较

通过酶联免疫吸附反应检测大鼠海马组织中的IL-10、TNF-α变化。我们发现与C组对比，M组和A组海马组织中的IL-10抗炎因子明显降低（P＜0.05），与M组相比，A组海马组织中的IL-10明显升高（P＜0.05）；与C组对比，M组和A组大鼠海马组织中的TNF-α炎症因子明显增加（P＜0.05），与M组相比，A组大鼠海马组织中的TNF-α明显降低（P＜0.05）。

图5 各组大鼠脑组织TNF-α和IL-10表达水平比较（n=5）

2.5 TLR4、NF-κB、JAK1和STAT1 mRNA在各组脑组织中的表达比较

使用RT-qPCR方法检测TLR4、NF-Kβ、JAK1和STAT1的转录水平。我们发现与C组比较，M组的TLR4、NF-Kβ、JAK1和STAT1的转录明显增加（P＜0.01）；同时与M组相比， A组的TLR4、NFKβ、JAK1和STAT1的转录显著降低（P＜0.05）。

2.6 TLR4/NF-Kβ、JAK1/STAT1信号通路相关蛋白及凋亡蛋白在脑组织中的表达比较

使用image J软件检测各组目的蛋白、内参蛋白或总蛋白的灰度值，目的蛋白在海马组织中相对表达量即为目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值或目的蛋白与总蛋白的灰度值比值。如图6.1所示Caspase3蛋白在M组和A组中表达较C组明显增加（P＜0.05）；与M组对比，A组Caspase3蛋白的表达明显降低（P＜0.05）。与此同时，M组Bcl-2蛋白表达较C组明显被抑制（P＜0.05），而A组Bcl-2蛋白表达较M组显著增加（P＜0.01）。

图6 各组大鼠海马组织TLR4、NF-κB、JAK1、STAT1的mRNA表达水平比较（n=5）

图6.1 Bcl-2、Caspase3蛋白在三组大鼠海马组织中的表达比较（n=5）

观察JAK1/STAT1信号通路相关蛋白在大鼠海马组织中的表达水平，如图6.2所示M组JAK1蛋白表达较C组明显升高（P＜0.05）；与M组相比，A组海马组织JAK1蛋白水平明显下降（P＜0.05）。同样M组海马组织STAT1蛋白磷酸化水平较C组明显增高（P＜0.05）；而A组海马组织STAT1蛋白磷酸化水平较M组明显降低（P＜0.05）。结果显示M组海马组织TLR4蛋白表达水平较C组明显增高（P＜0.05），而TLR4蛋白在A组海马组织中的表达水平较M组明显被抑制（P＜0.05）。同样，NF-κB蛋白在M组海马组织中的磷酸化水平较C组显著增加（P＜0.05）；与M组相比，A组海马组织NF-κB磷酸化水平明显下调（P＜0.05）。

图6.2 JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB通路相关蛋白在三组大鼠海马组织中的表达（n=5）

图6.3 各组JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB通路相关蛋白在海马组织中的表达比较

3 讨论

CIRI涉及脑水肿、神经元凋亡、血脑屏障破坏等病理现象[5]。CIRI不仅存在于缺血性脑卒中的治疗过程，也存在于颈部手术术后、术中低血压以及体外循环过程[8-11]。自由基损伤在CIRI中起着核心作用，大脑是全身耗氧量最高的器官，这种高耗氧量决定了大脑较其他器官更容易产生自由基[5]。现有研究发现引入外源性抗氧化剂有利于减轻脑缺血再灌注所带来的损伤。芦荟苷是从芦荟中提取的主要蒽醌苷，属于酪氨酸酶抑制剂，具有有抗炎、抗病毒、抗氧化等多种生物活性。

现发现多种药物改善脑缺血再灌注损伤的机制与JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB信号通路有关，同时有研究证明二者之间存在串扰关系[17-19]。神经炎症是导致CIRI最重要的机制之一，首先TNF-α在CIRI中起着重要作用，它可以增加血管内皮细胞通透性和细胞粘附分子表达，也能促进白细胞浸润和神经元凋亡的进程[25]；其次NF-κB是调节免疫反应和细胞存活的重要转录因子，它主要由缺血再灌注损伤过程中产生的ROS激活，NF-κB可以促进各类炎症细胞激活并释放炎症因子；同时在阿尔茨海默症中发现NF-κB与Tau蛋白、β样淀粉蛋白的代谢密切相关，我们认为NF-κB可能与脑缺血再灌注损伤愈后认知功能障碍密切相关[14,15,26,27]。

神经功能评分和脑组织梗死面积能直接反应脑组织损伤情况及芦荟苷治疗效果。本研究结果显示M组大鼠神经功能受到严重损伤，而注射芦荟苷药液后能够明显改善CIRI引起的大鼠神经功能障碍；TTC检测CIRI能引起脑组织梗死，而注射芦荟苷药液后能够有效减少大鼠脑组织梗死面积。苏木精-伊红染色是最适合观察组织损伤情况的实验技术，镜下发现CIRI引起大鼠脑组织及海马组织出现大量病理样改变，而注射芦荟苷能够有效改善缺血再灌注诱导的大鼠脑组织损伤。炎症贯穿CIRI的整个病理过程，并与预后及其他病理机制密切相关；通过分析脑组织中的NF-κB磷酸化和TNF-α、IL-10水平，我们发现芦荟苷能够有效抑制CIRI中的神经炎症。我们使用RT-qPCR和免疫蛋白印记法检测发现芦荟苷不仅可以抑制脑缺血再灌注引起的TLR4、NF-κB、JAK1、STAT1 mRNA转录，还会抑制TLR4、JAK1蛋白表达水平与NF-κB、STAT1蛋白磷酸化水平。Caspase3蛋白是细胞凋亡信号传导级联反应中重要的一环，而Bcl-2蛋白是细胞内重要的抗凋亡蛋白；根据免疫蛋白印记结果我们发现芦荟苷能够抑制脑缺血再灌注中的Bcl-2蛋白降低和 Caspase3蛋白升高。

综上所述，本研究表明芦荟苷能够改善脑缺血再灌注损伤，其机制可能JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB信号通路有关。