畸胎瘤衍生生长因子1对宫颈癌细胞体内外增殖的作用分析

杨亚楠，许晴晴，兀紫梦，任琛琛

（郑州大学第三附属医院，河南 郑州 450000）

1 背景

宫颈癌是起源于于女性宫颈的一种恶性肿瘤，主要发生于育龄期及绝经期女性，在2020年全球女性恶性肿瘤发病中占7.7%，在因恶性肿瘤死亡的女性患者中，宫颈癌占6.4%，仅次于肺癌，结直肠癌，乳腺癌，是女性癌症发病中第四常见的疾病[1]。在世界范围内的欠发达地区，宫颈癌的发病率较高，居女性恶性肿瘤的第2位[2,3]。对早期的宫颈癌患者，行根治性子宫切除术可提高患者的生存率。有研究表明，对肿瘤具有高级别特征，如切缘细胞受累，淋巴结转移，宫旁侵犯及远处转移的宫颈癌患者，术后使用辅助外照射放射治疗同时进行铂类化疗，可提高患者的总生存期和无进展生存期。对有中等危险因素的宫颈癌患者，使用辅助外照射放射治疗可减少宫颈癌患者的局部复发[4]。

畸胎瘤衍生生长因子1（Teratocarcinomaderived growth factor1，TDGF-1）又称Cripto-1，由于存在修饰的EGF样结构域而被归类于表皮生长因子相关肽家族[5]，在许多癌变及癌前病变，如胃肠上皮化生及乳腺导管原位癌中过表达[6]。除了干细胞，Cripto-1在正常组织中的表达水平很低[6]。在致癌转化过程中，Cripto-1在几种类型的人类癌症中重新表达，包括胃癌、结直肠癌、胰腺癌，乳腺癌等。在生殖系统恶性肿瘤如卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌等中Cripto-1的表达量亦有升高[7]。在肿瘤的发生过程中，Cripto-1可通过激活多种细胞内外信号通路，调节肿瘤细胞的增殖迁移侵袭，并与肿瘤细胞的放疗抵抗和化疗耐药有关[8]。有研究表明，Cripto-1亦可以激活经典wnt通路，引起头颈部鳞状细胞癌等多种癌细胞的增殖迁移及上皮间质转化[9]。本课题通过一系列体内外实验，研究了Cripto-1在体内外对宫颈癌细胞的增殖的作用。

2 材料与方法

2.1 材料

人Hela及SiHa细胞为郑州大学第三附属医院科研中心馈赠。为构建低表达Cripto-1因子的稳转宫颈癌细胞，我们委托上海吉凯基因生物公司，构建靶向沉默Cripto-1的慢病毒，该病毒载体为GV344，序列信息为：hU6-MCSUbiquitin-firefly_Luciferase-IRES-puromycin。

雌性裸鼠（4周龄，体重13-16g）购自北京SPF生物技术有限公司。实验前1周在郑州大学实验动物中心实验室饲养，以适应环境。这项动物研究的伦理申请由郑州大学动物研究伦理委员会批准。动物实验遵循《实验动物的照料和使用指南》。Cripto-1基因引物和GAPDH引物购自尚亚生物，兔抗人Cripto-1单克隆抗体和E-cadherin单克隆抗体购自CST公司，MMP-9单克隆抗体购自艾博抗公司，抗GAPDH抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，CCK-8试剂盒购自苏州宇恒生物科技有限公司。

2.2 方法

2.2.1 TCGA数据库

从TCGA中下载宫颈癌原始数据，包括临床预后数据，病理参数和Cripto1 mRNA表达水平，分析mRNA表达水平的差异与临床预后的关系，并进行生存曲线分析。

2.2.2 细胞培养及转染

Hela及SiHa细胞培养于高糖DMEM培养基中，培养基中含体积分数为10%胎牛血清及青霉素-链霉素。将培养瓶置于37℃、体积分数为5%的CO2恒温密闭培养箱中进行培养、消化和传代。使用慢病毒感染两株细胞，慢病毒载体为GV344载体。于六孔板中培养细胞，生长至20% -30%汇合度时，转染慢病毒载体。培养72小时之后，用0.25μg/mL的普利茅斯筛选单克隆细胞系，通过qrt-pcr检测验证Cripto-1的敲减效率。

2.2.3 RT-PCR

使用Trizol试剂从指定的细胞系中提取总RNA。利用反转录试剂盒合成cDNA，应用SYBR Premix Ex Taq Kit系统为基础，建立了荧光定量PCR的方法。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT方法进行数据分析及表达水平测定。β-actin引物序列为Foward：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’；Reserve：5’-AGGTCTTTGCGGATG TCCACGT-3’，Cripto-1引物序列为：Foward：5’-CAGGAATTTGCTCGTCCATCTCGG-3’；Reserve：5’-TAGTACGTGCAGACGGTGGTAGTT-3’。

2.2.4 Western-blot

转染后48h收集各组的细胞，按照蛋白提取试剂盒说明书步骤提取总蛋白液。BCA法测定蛋白浓度，配置5%的浓缩胶和12%的分离胶，进行SDS-PAGE电泳，再将电泳产物电转至PVDF膜上。含5%的脱脂牛奶摇床上封闭1h后，分别加入稀释好的Cripto-1、E-cadherin、MMP9和GAPDH（稀释比均为1:1000）的抗体中，4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜3次×10min。加入山羊抗兔免疫荧光二抗（稀释比例为1:5000），室温孵育1h。TBST洗膜3次×10min。利用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software测定Western blot条带净灰度值，并与内参照GAPDH的测定结果相比较，计算其比值。

2.2.5 CCK-8实验

用CCK-8法检测细胞增殖情况。在96孔板中接种细胞，密度为2×103个细胞/孔，在培养24，48，72，96小时后分别加入CCK-8试剂，继续培养2小时。使用酶标仪在450nm出测定每个孔的吸光度。

2.2.6 克隆形成实验

取对数生长期SiHa细胞及HeLa细胞，消化计数后，分别将2×103细胞接种于6孔培养板，每孔2mL单细胞悬液。培养10～14天，每天观察克隆形成情况，每3天更换培养基2次。至培养板中形成肉眼可见的克隆时，停止培养，以甲醇固定20min，0.2%结晶紫染液染色30min，最后于倒置显微镜下计数≥50个细胞数的集落为有效细胞集落，计算克隆形成率。

2.2.7 裸鼠异种移植瘤模型

将低表达Cripto-1慢病毒和阴性对照病毒稳定转染的SiHa细胞分别接种于裸鼠两侧腋下（5×106个细胞，每组4只），接种后每3天测量肿瘤体积，18天后剥离瘤体，测量瘤体终体积及重量。排除意外原因小鼠的死亡，最终有效数据为4对4。这项动物研究的伦理批准是由郑州大学动物研究伦理委员会批准。动物实验遵循《实验动物的照料和使用指南》。

2.2.8 数据分析

统计学分析使用了GraphPad Prism 8.0软件和SPSS 26.0统计软件进行了数据分析。计量资料使用算术均数±标准偏差表示，两组间比较采用独立样本t检验。以α=0.05为检验水准，P＜0.05视为有差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Cripto-1表达与宫颈癌预后相关

通过在线网站GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析TCGA数据库中278例宫颈癌患者Cripto-1 mRNA与生存期的关系，其中，蓝色曲线为Cripto-1低表达组，样本量n=145；红色曲线为Cripto-1高表达组，样本量n=133。结果如图1，图2所示，在278例宫颈癌患者中，Cripto-1的表达与患者总存活时间之间无明显关系（P＞0.05，如图1），但与低表达组相比，高表达Cripto-1因子的宫颈癌患者无进展生存时间较短，差异有统计学意义（P＜0.05，如图2），提示Cripto-1的表达可能减少宫颈癌患者的无进展生存时间。

图1 Cripto-1表达水平与宫颈癌患者总生存率（Overall survival）的关系，P=0.85

图2 Cripto-1表达水平与宫颈癌患者无瘤生存率（Diseasefree survival）的关系，P=0.015

3.2 Cripto-1促进宫颈癌的增殖

为构建低表达Cripto-1因子的稳转宫颈癌细胞，我们委托上海吉凯基因生物公司，使用慢病毒GV344载体，构建了Cripto-1-RNAi慢病毒。RT-PCR及Western-Blot结果证明，构建完成的实验组SiHa和HeLa稳转细胞株中，Cripto-1因子的表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），见图3。RT-PCR及Western-Blot证实稳转细胞株中Cripto-1因子的表达明显降低，即成功构建低表达Cripto-1因子的SiHa和HeLa稳转株。

图3 RT-PCR和Western blot检测慢病毒转染效率。（A）四组细胞中Cripto-1及内参蛋白表达水平。（B）四组细胞中Cripto-1及内参蛋白表达定量分析。（C）敲减Cripto-1后HeLa细胞中Cripto-1 mRNA表达水平定量分析。（D）敲减Cripto-1后SiHa细胞中Cripto-1 mRNA表达水平定量分析。数据使用算术均数±标准偏差表示，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

利用Cripto-1 RNAi慢病毒建立稳定的SiHa和HeLa细胞低表达细胞系。两株宫颈癌细胞系中的转染效率均较高。利用两株稳转细胞株，我们采用克隆形成实验及CCK-8实验研究了Cripto-1对宫颈癌细胞增殖作用的影响。CCK-8实验显示，经过相同时间的培养，Cripto-1低表达组细胞在OD=450nm处的吸光度明显低于对照组（P＜0.05，图4）；同时，克隆形成实验显示，经相同时间的培养，Cripto-1低表达组集落形成数低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.001，图5）。结果表明，Cripto-1基因的下调抑制了细胞增殖，并降低了宫颈癌细胞的克隆能力。

图4 Cripto-1促进宫颈癌细胞的增殖。（A）CCK-8法检测Cripto-1下调后HeLa细胞细胞连续4天的生长情况（B）CCK-8法检测Cripto-1下调后SiHa细胞连续4天的生长情况.**P＜0.01，*P＜0.05

图5 慢病毒处理后细胞的集落形成情况。（A、C）HeLa-Cripto1（-）组及HeLa-Vector组克隆形成情况及定量分析。（B、D）SiHa-Cripto1（-）组及SiHa-Vector组克隆形成情况及定量分析。数据使用算术均数±标准偏差表示。***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

3.3 Cripto-1在裸鼠成瘤模型中促进肿瘤生长

为进一步探究Cripto-1在体内的作用，我们利用裸鼠的异种移植瘤模型研究了Cripto-1对宫颈癌细胞体内增殖的影响。实验结果表明，在饲养时间相同的条件下，注射低表达Cripto-1因子的稳转SiHa细胞株的裸鼠皮下成瘤体积明显低于对照组（图6 A、C）。饲养28天后处死裸鼠，剥离瘤体并称重，结果显示，低表达Cripto-1组的肿瘤重量和体积显著低于对照组，差异具有统计学意义（图6 B、DP＜0.05）。结果提示Cripto-1因子的表达对裸鼠的皮下成瘤起促进作用。

图6 Cripto-1的低表达抑制小鼠模型中的肿瘤生长。（A）在处死小鼠后立即拍摄图像，上组小鼠为注射Cripto-1低表达细胞系组，而下组图像中的小鼠为对照组。（B）肿瘤重量。（C）从裸鼠身上切除的肿瘤。（D）每周测量肿瘤体积。数据使用算术均数±标准偏差表示。***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

4 讨论

宫颈癌起源于子宫颈，是女性较为常见的恶性肿瘤类型，其发病率与死亡率均较高，在2020年全球女性恶性肿瘤统计中，宫颈癌发病率仅次于乳腺癌，肺癌，结直肠癌，是女性癌症发病中第四常见的疾病[10]。在全球欠发达地区，宫颈癌的发病率居女性肿瘤第2位，仅次于乳腺癌[11]。传统观点认为，大多数宫颈鳞状细胞癌的发病与HPV感染有关，但越来越多的研究表明，部分宫颈癌患者可不伴随HPV感染，其病理类型多为腺癌[12]。对早期宫颈癌患者，行根治性子宫切除术可提高生存率，有研究表明，对肿瘤具有高级别特征，如切缘细胞受累，淋巴结转移，宫旁侵犯及远处转移的宫颈癌患者，术后使用辅助外照射放射治疗同时进行铂类化疗，可提高患者的总生存期和无进展生存期。对有中等危险因素的宫颈癌患者，使用辅助外照射放射治疗可减少宫颈癌患者的局部复发[13]。随着生物化学、分子生物学技术及细胞信号转导通路研究的进展，生物学标志物及基因靶点在癌症的诊断、治疗、预后方面逐渐开始发挥越来越重要的作用。靶向治疗药物是针对恶性肿瘤细胞明确位点而设计的药物，特异性高，不良反应较小，作用效果好，成为多种癌症的主流治疗方案[14]。同时，宫颈癌的治疗目前并没有有效可行的治疗靶点[15]。同时，放化疗抗性的产生是目前临床癌症治疗的主要障碍之一，分子靶向增敏治疗也是目前对宫颈癌治疗方法的研究热点之一[16]。因此，探讨并确定宫颈癌诊断，治疗，预后及随访的特异性生物学标志物有一定必要性。

畸胎瘤衍生生长因子-1（TDGF-1），又名Cripto-1，属于表皮生长因子/Cripto/FRL1/Cryptic（EGF-CFC）蛋白家族，定位在人类染色体3p21.3，编码Cripto-1蛋白[17]。Cripto-1蛋白分子量为21KD，属于膜相关蛋白，包含一个修饰的EGF样结构域、一个富含CFC半胱氨酸的结构域、一个NH2-末端信号肽和一个短的疏水COOH-末端，该末端包含糖基磷脂酰肌醇（GPI）切割和附着的短序列[18]。在早期胚胎内胚层与中胚层的形成过程中，通过参与Nodal信号传导的调节，参与了早期胚胎诱导过程[19]。研究显示，除了干细胞，Cripto-1在正常人体高分化组织及小鼠正常组织中的表达水平很低[20]。在正常组织的恶性转化过程中，Cripto-1在多种人类癌症中重新表达，包括结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌，生殖系统恶性肿瘤如卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌和睾丸癌[21]。亦有研究发现，Cripto-1的过表达可能与癌前病变如胃肠上皮化生、乳腺导管原位癌的发生相关[22]。另外，在长期幽门螺杆菌感染和萎缩性胃炎（胃癌发生的两个风险因素）的患者中，以及在属于遗传性结直肠癌高危人群中未发病的个体的正常肠粘膜中，Cripto-1分子亦有表达[23]。已有观点认为，Cripto-1可能成为恶性肿瘤及癌前病变诊断治疗的重要靶点。在一项对宫颈癌的研究中，Ertoy和collaborator收集临床样本的免疫组织化学研究结果显示，与正常宫颈组织相比，Cripto-1在早期宫颈癌患者的组织切片中的表达量增加，该研究还表明，Cripto-1高表达量与肿瘤的高风险特征，如肿瘤大小、切缘细胞受累、淋巴结转移、宫旁侵犯及远处转移相关，同时，在宫颈癌转移的盆腔淋巴结中，亦可见Cripto-1表达水平增加[24]。另一项研究结果显示，下调肝癌细胞HepG2中Cripto-1的表达可增加肝癌细胞中上皮间质转化标志物的表达，且与其对Dishevelled-3的稳定和Wnt/beta-catenin通路的激活相关[25]。

在临床肿瘤学研究中，恶性肿瘤患者的生存时间是衡量患者治疗受益程度的重要标准之一，通常包括总生存时间（Overall Survival,OS）、无进展生存时间（Progression-Free Survival,PFS）和中位生存时间（Median Survival Time，MST）。总生存时间指从病人确认患有疾病开始至因任何原因引起死亡的经过的时间，通常认为总生存时间是衡量抗肿瘤治疗的最佳指标。无进展生存时间通常定义为患者接受治疗开始，直到疾病进展（如肿瘤复发）或因各种原因出现死亡的时间，对于很多病人生存时间普遍较长的癌症，如宫颈癌、乳腺癌等，PFS可反映肿瘤的生长，并不受交叉治疗和后续治疗的影响，可作为此类恶性肿瘤的主要终点指标或次要终点指标[26]。对TCGA数据库中278例宫颈癌患者的生存分析结果表明，Cripto-1的高表达水平对宫颈癌患者总生存时间无明显影响，但可能导致宫颈癌患者无进展生存时间的缩短，此结果提示Cripto-1的表达可能为宫颈癌不良预后的危险因素。

为进一步探讨Cripto-1在宫颈癌中的生物学作用，我们设计了一系列体内外实验。我们在宫颈癌SiHa和HeLa细胞中进行了一系列细胞功能学实验。增殖失控是恶性肿瘤细胞的特征性行为之一，也是评价肿瘤恶性程度的重要指标之一。细胞增殖实验结果证明，Cripto-1基因促进了宫颈癌的细胞增殖行为，并增加了细胞的克隆能力。

我们的体外实验结果提示，Cripto-1的下调能有效抑制宫颈癌细胞的增殖。为进一步探究Cripto-1在体内的作用，我们利用裸鼠的异种移植瘤模型研究了Cripto-1对肿瘤体内增殖的影响。实验结果显示，在经过相同的成瘤时间，注射低表达Cripto-1因子的稳转SiHa细胞株的裸鼠皮下成瘤体积明显低于对照组，且处死裸鼠并剥离瘤体称重的结果显示，低表达Cripto-1组的肿瘤重量显著低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果提示Cripto-1因子的表达对裸鼠的皮下成瘤起促进作用。

5 结论

本研究结果表明，高表达Cripto-1的宫颈癌患者无进展生存时间较短，提示其与宫颈癌的不良预后有关。Cripto-1在体内外均可促进宫颈癌细胞的生长。