基于生物信息学方法探讨肛门湿疹差异基因的免疫浸润及中药预测分析

朱凤仪 ，张涛 ，周小勇 （通信作者*）

（1.湖北中医药大学第一临床学院，湖北 武汉 430000 ; 2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

0 引言

肛门湿疹（Anal eczema, AE）是指发生于肛门周围皮肤，以瘙痒、潮湿、散在丘疹及渗液为主要表现的皮肤疾病[1]。AE的发病机制复杂[2]，多与生活环境、气候条件等外在因素和感染、免疫、内分泌失调等内在因素相互作用有关[3]。当前对AE的治疗多以抗组胺类药物、糖皮质激素及对症治疗为主[4]，但因其易复发，迁延难愈多不易被患者接受。免疫因素在AE 的发病中发挥着重要作用，因此从免疫细胞浸润对AE发病机制进行探讨，对实现AE的精准治疗有重要意义。故本次研究基于AE患者基因芯片，筛选差异表达基因，通过CIBERSORT反卷积算法，进行免疫细胞浸润分析，以期为AE的免疫精准治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 AE基因芯片数据

登录GEO基因芯片数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）， 以“Anal eczema”“Perianal Eczema”“Eczema”为关键词检索基因芯片数据及平台文件，通过平台文件将芯片数据转化为基因名称。

1.2 差异表达基因的确定

借助R软件的“limma”程辑包对AE及健康对照组的基因表达数据进行差异分析，以|logFC|≥ 2，P＜0.05为筛选条件[5]，以 logFC 的正负值代表基因的上调及下调表达，在R软件中安装“ggpubr”“ggplot2”“pheatamp”程辑包，绘制差异表达基因火山图及热图，选取上调及下调排名前20的基因绘制偏差图。

1.3 差异表达基因蛋白互作网络及核心蛋白筛选

登录 String 数据库（https://string-db.org/），选择Multiple proteins，在搜索条目下输入1.2获取到的差异表达基因，限定物种为Homo Sapiens，最低交互评分设置为0.9，设置自动删除游离基因，其余设置保持不变，构建PPI功能蛋白作用网络，并绘制网络图。为筛选核心蛋白，将生成的蛋白相互作用条目Node1、Node2以及Combined-scorce导入到Cytoscape3.8.0，选择APP条目下的CytoNCA插件进行网络拓扑分析。

1.4 差异表达基因的GO、KEGG富集分析

基于R软件对1.2中获取到的EOA差异表达基因的细胞成分、分子功能、生物学过程以及信号通路进行富集分析。在Bioconductor（https://www.bioconductor.org/）网站安装“Biocmanager”“org.Hs.eg.db”“Colorspace”“Stringi”“DOSE”“ClusterPr ofiler”“enrichplot”“Pathview”等程辑包。选择物种为人（Homo spanies），设定P＜0.05，对 EOA 差异表达基因及logFC值进行富集分析，输出富集结果并绘制圈图。

1.5 获取免疫浸润矩阵

将GEO数据库获取到的基因芯片数据分组，登录CIBERSORT数据库获取免疫细胞基因表达矩阵[6]。通过反卷积算法进行免疫浸润分析，包括T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞等22中免疫细胞的矩阵，为获取数据的准确性，设定P＜0.05，循环次数为100次。

1.6 免疫矩阵的主成成分分析

为分析AE患者与健康对照组间的差异，通过R语言对对1.5中获取的免疫浸润矩阵进行主成成分分析，借助“ggplot2”程辑包绘制PCA图。

1.7 免疫浸润分析

通过R语言对纳入样本的UC与正常对照组的组织样本进行22种免疫细胞浸润分析，获取AE与健康对照组免疫细胞差异情况及特征，绘制相关性热图及小提琴图。

1.8 AE免疫细胞浸润潜在中药预测

登录Coreminemedical数据库（https://www.coremine.com），将1.3中获得关键靶基因及1.4中获得到的免疫相关生物学过程输入Coreminemedical，设置P＜0.05。绘制网络图。

2 结果

2.1 EOA差异表达基因结果

通过对GEO数据库AE相关基因探针筛选，确定GSE63741基因芯片数据及GPL19471平台文件作为本次研究对象。包括29名AE患者及30名健康对照组，共59个样本的基因表达数据，获得差异表达基因92个，其中49个上调基因，43个下调基因。选取上调及下调排名前20的差异基因绘制差异表达偏差图和热图，见图1A，图1B，选取所有差异表达基因绘制火山图，见图1C。

图1 差异表达基因的偏差图热图及火山图

2.2 PPI蛋白互作网络构建及关键蛋白筛选

在STRING网站构建差异表达基因蛋白互作网络，去除游离基因后结果见图2A。为筛选网络关键蛋白，将得到的string_interactions.txt文件导入到Cytoscape3.8.0，选择CytoNCA对网络进行拓扑分析。筛选参数：介度中心性（Betweenness Centrality），紧 密 中 心 性（Closeness Centrality），节 度 中 心 性（Degree Centrality），特 征 向量（Eigenvector Centrality），局 部 连 通 性（Local Average Connectivity-based method LAC），网络关键蛋白为 CCL2、CCND1、S100A7，见图2B。

图2 差异基因PPI网络图及网络关键蛋白

2.3 GO及KEGG富集分析

通过R语言对AE差异表达基因进行GO功能及KEGG通路富集分析，GO共富集到137个生物学过程（BP）条目，免疫相关生物学过程涉及到角质细胞分化、皮肤角化等免疫相关途径。KEGG通路富集到了6个通路结果，主要涉及金黄色葡萄球菌感染、雌激素信号通路、IL17信号通路。根据富集结果，各自选取排名前5的GO条目及KEGG通路，根据logFC值，绘制圈图，见图3A，3B。

图3 差异基因富集结果圈图

2.4 EOA的免疫分布特征

在CIBERSORT数据库中获得22中免疫细胞矩阵，通过反卷积法以P＜0.05，循环100次，共获得59个可信样本的免疫细胞浸润矩阵，对免疫细胞浸润矩阵的组成成分分析，结果显示AE组与健康组见差异区分明显，见图4A。图4B显示了免疫细胞浸润比例，左侧30个为健康组织样本，右侧29个为AE组织样本。结果显示，单核细胞（Monocytes）在两组间均呈现较高比例。静息树突状细胞（Dendritic cells resting）、幼稚 CD4 T细胞（T cells CD4 naive）在AE组占比较高。记忆性B细胞（B cells memory）、活化NK细胞（NK cells activated）在正常组中占比较高。根据样本中免疫细胞浸润比例绘制热图，见图4C。

图4 AE的免疫分布特征

2.5 免疫浸润差异分析

根据免疫细胞在不同组织间的差异表达量，以P＜0.05为标准对AE组及健康组的免疫浸润差异进行可视化分析，绘制小提琴图，见图5，结果显示，M1型巨噬细胞（Macrophages M1，P=0.01），静息树突状细胞（Dendritic cells resting，P=0.021），活化的树突状细胞（Dendritic cells activated，P＜0.001），活化的肥大细胞（Mast cells activated，P＜0.001），在AE组织中表达明显增加。记忆性 B 细胞（B cells memory，P=0.003），巨噬细胞M2（Macrophages M2，P＜0.001），在正常组织中表达明显增加。

图5 AE的免疫浸润差异分析小提琴图

2.6 免疫细胞相关性分析

为探究免疫细胞间是否相关，对22中免疫细胞进行相关性分析，见图6，颜色越红则正相关性越强，颜色越蓝则负相关性越强。幼稚CD4 T细 胞（T cells CD4 naive） 与 CD8 T细 胞（T cells CD8）有较强的正相关（r=0.68），巨噬细胞M0（Macrophages M0）与单核细胞（Monocytes）有较强的正相关（r=0.39）。γT细胞（T cells gamma delta）与活化的NK细胞（NK cells activated）有较强的负相关（r=-0.39），幼稚B细胞（B cells naive）与浆细胞（Plasma cells）有较强的负相关（r=-0.35）。

图6 EOA的免疫细胞相关性分析

2.7 AE免疫细胞浸润中药预测结果

通过Coreminemedical数据库预测UC免疫细胞浸润有效中药，设置P＜0.05，结果显示，黄柏、苦参、苍术、连翘、栀子、生地黄、龙胆与AE免疫细胞浸润关联度较高，提示其可能作为治疗AE的有效中药通过调节免疫细胞及功能起到治疗EOA的作用，见图7。

图7 EOA免疫浸润中药预测网络图

3 讨论

随着经济社会的发展，高蛋白高热量饮食的摄入，AE的发病率呈逐年升高的趋势[7]。肛门皮肤瘙痒、渗液等临床症状典型，虽不危及生命，但病情迁延难愈，反复发作，严重影响了患者的生活质量[8]。AE的发病与局部炎性因子释放，免疫变态反应密切相关。因此寻找新的免疫治疗靶点对AE的诊疗具有重要意义。本次研究通过对AE差异表达基因的PPI网络构建与富集分析，筛选出CCL2、CCND1、S100A7为关键靶基因。CCL2是由细胞分泌的信号蛋白，具有诱导免疫细胞定向趋化的功能[9]，研究表明[10]，CCL2可以在Fas配体的作用下活化，导致湿疹表皮角质化，加剧炎症反应。CCND1为特异性周期蛋白，与细胞增殖密切相关[11]，在AE发病时，大量免疫细胞在发病部位浸润增殖，CCND1介导免疫变态反应。S100A7是一种促炎蛋白，又被称为银屑素，最早发现于银屑病患者血清中，与病情程度呈正相关[12]，研究表明[13]，S100A7的水平与银屑病皮肤组织IL4、IL22、IL26表达正相关。目前有关S100A7与AE的相关性尚未有报道，这可能是AE的新的治疗靶点。本次研究筛选到的关键靶基因在AE的诊疗上提供新的治疗靶点与研究方向。

对AE差异表达基因的GO、KEGG富集结果显示，涉及角质细胞分化、皮肤角化等免疫相关途径；与金黄色葡萄球菌感染、雌激素信号通路、IL17信号通路密切相关。固有免疫功能的正常是避免湿疹发病的关键，GO富集到的角质细胞分化，皮肤角化等生物学过程是AE发病时主要的病理变化，皮肤角化指的是AE发病时肛周皮肤的炎性退行性病变[14]，角质细胞是构成表皮层的主要细胞成分，角质细胞分化是皮肤角化的基础[15]，抑制肛周皮肤的角质化对治疗AE有重要意义。由于肛门周围皮肤位置的特殊性，致使其容易受到各种致病菌的感染。研究表明[16]，湿疹患者皮损部位的金黄色葡萄球菌密度要显著高于非皮损部位，金黄色葡萄球菌感染是导致AE炎性病变的重要原因[17]。激素水平与湿疹的发病密切相关，研究表明[18]，女性患者湿疹的发病率显著高于常人，雌激素的周期性波动会导致皮肤免疫及屏障功能降低，加重炎症性皮肤病的病情程度。IL-17是Th17细胞的主要效应因子[19]，由活化的T细胞产生[20]，可刺激上皮细胞、成纤维细胞产生IL-6、TNF-α等炎症细胞因子导致皮肤炎症反应[21]。GO及KEGG富集结果综合显示了AE的发病过程是由多种免疫功能及激素水平失调导致炎性因子的高表达的结果。

为探究免疫细胞浸润在AE发病中的作用，采用反卷积法以P＜0.05为标准进行免疫细胞浸润分析，M1型巨噬细胞，静息树突状细胞，活化的树突状细胞等在AE组织中表达明显增加。巨噬细胞位于胃肠道粘膜固有层中,受NF-κB调节，参与Th、Treg介导的免疫反应[22]。单核细胞受不同刺激后活化为M0、M1型或M2型巨噬细胞，M1型分泌促炎因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和趋化因子CXCL8、CXCL10，促进炎症反应[23]，M2型分泌抑炎因子IL-10及TGF-β，抑制炎症反应[24]。树突状细胞是起哨兵作用的抗原提呈细胞[25]，主要位于表皮固有层，受抗原刺激激活后，其树突状突起伸入上皮，交错进入上皮细胞，粘附抗原和细菌，并释放IL-2，诱导单纯T细胞向Th1细胞分化，激活适应性免疫应答[26]。本次研究发现，巨噬细胞M1在AE皮损组织中高表达，巨噬细胞M2型在正常组中高表达，表明本次免疫细胞浸润预测的AE免疫分析具有一定的参考意义。

AE属中医学“湿疹”的范畴，湿热是造成AE发病的重要原因，或因素体脾虚，湿邪内生；或因肆食肥甘厚味，损伤脾胃，内生湿热，湿热下注肛门发病；或因久居湿热之地，外感六淫侵袭机体，湿热之邪困遏肌表，发为AE。中医药在AE的诊疗上可以辨证论治，清热利湿，祛风止痒，疗效稳定。本次研究将获得到的AE关键靶基因及免疫生物学过程通过Coremine数据库对潜在治疗AE免疫浸润相关的中药进行预测，结果显示，黄柏、苦参、苍术、连翘、栀子、生地黄、龙胆出现频次较大，黄柏、苦参可清热利湿止痒，连翘、栀子清热解毒，苍术健脾燥湿，生地养阴生津，龙胆清热泻火。本次研究预测的中药在临床中皆在AE的治疗上有着广泛的应用，如复方黄柏液，苦参胶囊等，在临床中治疗AE取得了显著的疗效。

综上所述，本次研究基于生物信息学的分析方法对AE的差异基因进行富集及免疫细胞浸润机制分析，预测了潜在治疗中药，对后续的研究及中药临床应用具有一定的指导意义。