解酒茶配方优化及对急性酒精中毒小鼠解酒作用的研究

朱佳依，袁海波，滑金杰，王近近，杨艳芹，沈 帅，江用文

(中国农业科学院茶叶研究所，国家茶产业工程技术研究中心，农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江省茶叶加工工程重点实验室，浙江杭州 310008)

随着经济发展和生活水平提高，饮酒人数逐年增加，急性酒精中毒的发生率随之大幅增加，不但严重损害大众健康，也非常容易产生许多社会问题。研究发现，乙醇进入机体后主要依靠肝脏代谢，由乙醇脱氢酶作用后转化为乙醛，再在乙醛脱氢酶的作用下转化为乙酸，从而排出体外。在乙醇的代谢过程中，会使机体氧化性应激增强，导致肝脏机体的损伤。因此，在不能立刻拒绝饮酒时，解酒保肝成为克服饮酒所带来的伤害的又一途径。我国的药食同源植物资源丰富，自古以来已发现众多具有解酒保肝、抗氧化功效的植物，此外由于作用独特、方便携带、应用广泛等优点，袋泡茶这一形式广受市场青睐。

葛根、枳椇子是我国药食同源物质，其营养价值和药用价值十分丰富，也是经典的解酒原料。根据《千金要方》《神农本草经》等古代医药文献中记载，葛根在唐代就被用于“解酒毒”。葛根中所含的葛根异黄酮等生物活性物质可以清除乙醇及代谢产物，具有解酒护肝作用。枳椇子，鼠李科植物枳椇的成熟种子，《本草纲目》等文献记载，枳椇子在民间亦被广泛用于“治酒病”。药理研究表明，枳椇的解酒、护肝和抗病毒等作用均与其中的黄酮类成分有关，且中医处方也验证两者之间无配伍禁忌，结合使用具有止渴除烦、清湿热、解酒毒的功效。茶叶中大量的茶多酚和茶褐素可显著降低乙醇和乙醛浓度，提高肝中乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)酶活性，并缩短醉酒小鼠醉睡时间，咖啡碱通过兴奋大脑，还可以达到“醒酒”的效果，但茶汤浓度不宜太高。罗汉果中含有的黄酮类等成分都利于解酒醒酒、保护肝脏。另外饮茶还可以稀释酒精，促进胃肠蠕动，减少酒精的吸收。但是，目前研究多集中于解酒配方的优化，往往忽略了感官口感的需求，或局限于单一功能评价手段，缺乏全面和系统的研究。同时，将解酒类药食同源原料与红茶联合应用于袋泡茶方面的研究也鲜有报道。因此，该研究选择葛根、枳椇子、红茶和罗汉果作为配方基础，以解酒活性物质总黄酮及感官审评分数为指标，研究解酒袋泡茶的配方优化；通过建立急性酒精中毒小鼠模型，观察醉酒行为学指标以及测定血乙醇含量、肝脏生化指标，探讨葛根、枳椇子、红茶、罗汉果混合配方解酒袋泡茶的解酒功效，为解酒茶类产品研发提供基础数据。

1 材料与方法

试材。葛根(益阳神奇草养生茶业有限公司)，枳椇子(深圳市泰斯古德食品实业有限公司)，罗汉果(上海梅家坞茶业有限公司)，红茶(课题组自制)；实验动物：SPF级雄性ICR小鼠100只，体质量18～22 g，由杭州医学院提供，许可证号SCXK(浙)2019-0002。动物饲养于清洁级动物房，设定室温20～26 ℃，湿度40%～70%，光照12 h明暗交替。

药物及试剂。海王金樽(深圳市海王健康科技发展有限公司，批号20210302)；56°北京二锅头酒(北京二锅头酒业股份有限公司，批号20201118)；血乙醇(ALC)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20210802)；乙醇脱氢酶(ADH)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20211101)；乙醛脱氢酶(ALDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20211101)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司，批号1221221323)。亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化铝(上海国药，分析纯)；芦丁对照品(源叶生物科技有限公司，纯度95%)。

仪器与设备。Centrifuge 5810R型离心机(Eppendorf公司)；Power Wave XS型全波长酶标仪(Gene 公司)；T10型自动组织匀浆机(IKA公司)；HH2型数显恒温水浴锅(力辰科技有限公司)；UV-1800型紫外分光光度计(岛津公司)。

解酒茶的配方优化设计。使用粉碎机将葛根、枳椇子、红茶和罗汉果适当粉碎过6号筛，备用。配方试验以感官评分(香气、汤色、滋味)和总黄酮含量作为评价指标，采用试验设计软件Design Expert中混料设计D-Optional方法对解酒茶的配方进行优化，确定葛根、枳椇子、罗汉果和红茶的最佳配比。设定葛根(A)、枳椇子(B)、红茶(C)和罗汉果(D)为4个参数，其中红茶与罗汉果在配方中所占比例不超过50%，A + B + C + D = 100%，经预试验后葛根、枳椇子、红茶和罗汉果的质量选定范围如表1所示。

解酒茶总黄酮含量测定。以芦丁为标准品，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定总黄酮含量，标准曲线为=6527 7+8×10(=0.999 4)。取配备好的解酒茶(3 g/袋)，加入150 mL 100 ℃纯净水冲泡5 min。用移液枪精确吸取1 mL解酒茶茶汤置于25 mL容量瓶中，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法得到待测样品，在波长511 nm处测定吸光度，通过标准曲线计算出总黄酮含量。

表1 各指标的设定

解酒茶的感官评价。取制备好的袋泡茶以150 mL的100 ℃蒸馏水冲泡5 min后，组织5名品评员分别从汤色、香气和滋味进行品评打分。感官评分标准参照GB/T 24690—2018《袋泡茶》制定，并结合产品特点进行适当修改(表2)。

表2 解酒茶感官评分标准

动物分组及给药。将配制好的解酒茶在100 ℃下水浴提取，料水比为1∶10，浸提30 min，过滤，浓缩至0.8、0.4、0.2 g/mL备用。小鼠随机分成5组，分别为模型组、解酒茶低剂量组、解酒茶中剂量组、解酒茶高剂量组、海王金樽对照组，每组10只，分别根据动物药理试验用药折算方法，以人体剂量的10、20和40倍作为试验的低剂量、中剂量和高剂量组。试验分2次进行，禁食不禁水12 h后，各组小鼠分别灌胃相应药液0.02 mL/g(模型组灌胃等量水)，低剂量为4 g/kg，中剂量组8 g/kg，高剂量组16 g/kg；海王金樽对照组小鼠灌胃给予剂量为4 g/kg。30 min后，空腹灌胃给予北京二锅头酒(56°)0.015 mL/g。

解酒茶对醉酒小鼠的解酒评价。给予白酒后开始计时，观察并记录造模以及给药期间小鼠有无死亡、呕吐、乏力等症状，记录小鼠翻正反射消失和恢复时间，计算小鼠醉倒率、醉酒潜伏期和醉酒维持时间(柔和地翻转小鼠，使之出于仰卧位，30 s内不能翻正则判定为醉酒，即记录醉酒潜伏期；恢复翻身反射判定为醒酒)。

解酒茶对醉酒小鼠的酒精代谢评价。给予白酒后，每隔1 h眼眶取血，3 h内共取血3次，室温静置后，2 000 r/min离心，取上清-20 ℃保存备用，按照试剂盒操作说明，测定血乙醇(ALC)浓度。于末次小鼠取血后处死并取肝脏，各组拍照，-80 ℃保存备用，肝组织制备成肝组织匀浆，按照试剂盒操作说明，测定ADH、ALDH水平。

2 结果与分析

按照软件设计的试验组合进行复配，试验方案和结果见表3。应用 Design-expert 软件对响应值的试验值进行二次多项回归拟合，建立感官分数和总黄酮含量的回归模型，回归模型方程如下：

感官分数=83.32A+86.32B+92.37C+84.04D

总黄酮含量=1.65A+0.49B+3.77C+0.22D

对模型方程进行方差分析，结果发现，总黄酮含量和感官分数的线性模型均呈极显著水平(<001)，判定系数()均大于0.85，表明试验结果与模型拟合程度良好。

表3 设计方案和结果

在混料试验设计中可以根据三元等值线图直观反映各原料组分的变化对响应值的影响。由软件得到各原料交互作用的等高线图和三维曲面图。如图 1 所示，感官评分随着红茶的添加量增加而明显上升；提高枳椇子和葛根的添加量，则感官评分降低；葛根冲泡后茶汤中会带有淡淡草木清香味，同时茶汤口感醇和，可以在规定比例内适当提高其用量。红茶的添加对汤色、香气和滋味均有较好的提升作用，但由于并不具有较强的解酒功效，因此需控制红茶添加量来平衡功效和口感的协调。枳椇子泡水后带有轻微的苦涩味，会加重茶汤的涩味，降低感官评分，但由于其可以同时赋予茶汤特有的烘烤果仁香味，可以适当少量添加。

图1 葛根、枳椇子、红茶对感官分数交互影响的等高线图和三维曲面图Fig.1 Contour map and three-dimensional surface map of the interaction of Radix Puerariae，Semen Hoveniae and black tea on sensory score

从图2可以看出，当适当控制红茶的添加量，提高葛根的添加比例更有利于增加茶汤中总黄酮的溶出量。响应曲面随着红茶和葛根添加量增加的方向显著倾斜，说明红茶和葛根添加量对茶汤中总黄酮含量影响较强，是解酒茶中最主要的黄酮贡献组分。这与红茶和葛根中均含有丰富的黄酮类成分有关。从图2还可以看出，黄酮含量随着枳椇子添加量的增加没有明显的增幅。枳椇子含有解酒活性物质黄酮类化合物，如黄酮醇、二氢黄酮醇、黄酮、二氢黄酮和二倍体黄酮醇等，但推测由于果实粉碎度不高，其黄酮类成分未能在茶汤中大量溶出。

图2 葛根、枳椇子、红茶对总黄酮含量交互影响的等高线图和三维曲面图Fig.2 Contour map and three-dimensional surface map of the interaction of Radix Puerariae，Semen Hoveniae and black tea on the content of total flavonoid contents

解酒茶配方的确定优先考虑其解酒功效，因此，以最大程度获得活性物质(总黄酮含量)为要点，根据三维曲面试验结果和对各组分的限制条件，使红茶的添加量尽可能不超过50%，在保证解酒茶口感醇和的同时，赋予解酒茶良好的解酒功效。得到解酒茶配方的最优组合为红茶50.0%、葛根41.7%、枳椇子8.3%、罗汉果0%。根据优化后的配方进行验证试验，得到解酒茶的总黄酮含量为26.12 mg/g，感官评分为88.10分，与预测值基本接近，说明混料设计法在解酒茶配方设计和优化中的应用有效。

对小鼠给予白酒后，立刻进行“翻正反射”试验来判断醉酒与醒酒状态，每1 min 观察一次，造模及给药期间小鼠无死亡、呕吐等症状(图3)。由表4可知，中剂量组和高剂量组中均有1只保持“翻正反射”现象，即没醉；小鼠醉酒潜伏期从短到长依次为海王金樽对照组<模型组<中剂量组<低剂量组<高剂量组。与模型组相比，解酒茶中剂量和高剂量组的醉倒率为90%；低、中、高剂量组的醉酒潜伏期均有延长，平均延长24.44 min，其中高剂量组显著延长(<0.01)，将醉酒时间延长至69.00 min。小鼠醉酒维持时间从长到短依次为模型组>海王金樽对照组>低剂量组>中剂量组>高剂量组；低、中、高剂量组的醉酒维持时间均显著缩短(<0.01)，将醉酒维持时间缩短至62～152 min，平均缩短了205.18 min。由此可看出，解酒茶能延长小鼠的醉酒潜伏期并且缩短小鼠的醉酒维持时间，对醉酒小鼠有一定的防醉和解酒作用。

图3 小鼠急性酒精中毒高剂量组(a)和模型组(b)Fig.3 High-dose group(a)and model group(b)of acute alcoholism in mice

表4 解酒茶对小鼠急性酒精中毒的预防作用(n=10)

血液中酒精浓度也能反映酒精中毒严重程度。从图4可以看出，酒精处理后的模型组小鼠血液中酒精浓度达1 913.3 mg/L。与模型组相比，解酒茶各剂量组1、2 h的血乙醇浓度都显著降低(<0.05)，在2 h时降低至507.9～767.9 mg/L，其中中剂量组的3 h血乙醇浓度依旧显著低于模型组(<0.01)，浓度为490.1 mg/L；海王金樽对照组仅在第1小时显著降低血乙醇浓度(<0.01)，且在2、3 h时高于模型组。此结果表明解酒茶可显著降低急性酒精中毒小鼠血液中的酒精含量。

从图5可以看出，与模型组相比，解酒茶低、中、高剂量组均小幅提高了ADH活力，但并无显著差异，海王金樽对照组显著提高了ADH和ALDH活力(<0.05)；解酒茶高剂量组能显著提高ALDH活力(<0.01)，表明解酒茶高剂量组能明显提升乙醛氧化成乙酸的速度，促进了酒精在肝脏中的分解代谢，降低乙醛对肝脏的损伤作用。试验结果表明解酒茶具有的解酒功效可能是通过激活肝脏ALDH 活力，加速乙醛的分解，从而降低体内乙醇浓度来实现的。

注：*表示与模型组比较P<0.05；**表示与模型组比较P<0.01Note：* means P<0.05 compared with model group；** means P<0.01 compared with model group图4 解酒茶对醉酒小鼠血乙醇浓度的影响(n=10)Fig.4 Effect of anti-alcoholism tea on serum ethanol concentration in drunken mice(n=10)

注：*表示与模型组比较P<0.05；**表示与模型组比较P<0.01Note：* means P<0.05 compared with model group；** means P<0.01 compared with model group图5 解酒茶对醉酒小鼠酒精代谢酶活性的影响(n=10)Fig.5 Effect of anti-alcoholism tea on the activity of alcohol metabolism enzymes in drunken mice

3 讨论与结论

急性酒精中毒是当今世界的一大医学和社会问题，给人们的日常生活带来许多严重危害和问题。当饮酒后，90%以上的乙醇通过肝脏途径代谢，首先被 ADH 氧化成乙醛，再经过 ALDH 被氧化为乙酸，最后通过三羧酸循环被分解为 CO和HO。试验证明，大量饮酒会对肝脏组织造成损伤，造成ADH、ALDH活性下降，进而影响酒精代谢速度，使血液中乙醇浓度升高。因此，测量血清乙醇浓度、肝ADH、ALDH活性，能够反映出乙醇在体内的代谢情况以及肝脏损害程度。

该研究应用混料设计法探索解酒茶以功效和口感为基础的最优配方，得到各原料添加的最优比例为红茶50.0%、葛根41.7%、枳椇子8.3%、罗汉果0%，此配方下所得袋泡茶中总黄酮含量26.12 mg/g，感官评分88.10分。冲泡后茶汤橙黄明亮，带有淡淡果香味，口感醇正，回味甘甜。同时，还进一步探究了解酒茶对醉酒模型小鼠醒酒能力的影响，结果显示，解酒茶低、中、高剂量均能延长醉酒潜伏期，显著缩短醉酒维持时间，明显改善醉酒小鼠的行为学指标。同时，该研究测定了小鼠灌胃白酒后 1、2、3 h 的血乙醇浓度变化，结果显示，低、中、高剂量组显著降低了小鼠饮酒后1、2 h的血乙醇浓度(<0.05)；且中剂量组的血乙醇浓度在3 h后依旧显著低于模型组(<0.01)，表明解酒茶能够较好地降低血乙醇浓度，且中剂量组体现了良好的持续性功效。此外，肝脏生化指标试验结果显示解酒茶高剂量组有效增强了ALDH的活性，提示解酒茶可能通过提高肝脏中ALDH的水平，加快酒精的转化过程，从而起到防醉、解酒的作用，有效避免或减轻酒精造成的急性肝脏损伤。

综上所述，该研究从配方组合、动物行为学指标检测和生化指标测定这3个层面探讨了葛根、枳椇子、红茶、罗汉果复合袋泡茶的配方优化和解酒功效，在保证解酒功效的基础上，提高其香气和口感和滋味，使其更易为市场接受。为今后进一步研究解酒作用机制提供试验基础，也为解酒保健产品的开发应用提供科学依据。