纳米氧化锌浸种对铅胁迫下水稻种子萌发生理的影响

梁金燕， 廖 荣， 田 华， 王树丽， 莫钊文(华南农业大学农学院， 广东 广州 510642)

水稻(OryzasativaL.)是我国主要粮食作物之一，近年来，由于环境的破坏，给水稻生产带来了威胁[1-2]。我国耕地土壤主要受到镉、镍、铜、铅等污染[3-4]。农业生产中含铅化肥农药的不合理使用、汽车尾气的大量排放等因素致使土壤铅污染加剧，且从土壤到植物，铅表现出极高的迁移率，所以铅污染是影响农产品质量安全的重要污染物。当土壤中的铅积累到一定程度时，会通过作物吸收以及食物链传递而在人体中积累，危害人类健康[5-6]。因此，缓解铅对农作物生长的影响，对保障农产品的安全生产具有重要意义。

铅作为污染物中毒性较大的一种重金属，通常当其含量达到一定范围时，就会毒害作物，其毒性作用因铅处理浓度的不同、处理品种的不同、作用部位的不同、生长环境的不同而存在差异。总的来说，铅会对植物正常的生长发育产生影响，进而影响其品质，具体表现为抑制种子萌发和幼苗生长、降低生物量、影响光合作用等[7-11]。钟静等[8]研究发现，水稻种子的萌发对于Pb2+浓度表现出低促高抑的现象，且其抑制作用的大小与Pb2+浓度呈正相关关系。王锦文等[8]研究表明，在铅胁迫下水稻芽和根的伸长会受到抑制，对水稻幼苗生长产生不利影响。李琦[9]在研究高浓度CO2和铅胁迫下水稻幼苗的生理时发现，单独铅胁迫处理下水稻幼苗的呼吸作用受到抑制，表现为胞间CO2浓度、气孔导度、蒸腾速率等显著降低。当土壤中铅污染达到一定程度时会严重影响水稻的生长特性，如造成分蘖数下降，限制作物的光合作用，使得地上及地下营养部分的生物量降低，从而影响水稻的品质和产量[10-11]。作物的生长始于种子的萌发，前期幼苗的素质也对作物后期的生长有着重要影响，因此，寻求能够缓解铅胁迫对种子萌发的毒害作用的技术已经刻不容缓。

随着纳米技术研究的不断深入，纳米材料具有小尺寸效应和较大的比表面积等优良属性，被广泛应用于生产和日常生活中，在农业生产中的应用研究也多有报道。王学茹等[12]研究表明，纳米材料可激发生物体产生大量的活性氧自由基，使体内的生物大分子如脂质、核酸等发生过氧化，从而影响生物的生理代谢过程。同时，纳米材料对植物生长存在着积极影响[13-15]。薛琳等[13]总结了许多关于纳米材料对植物生长的积极作用，包括打破种子休眠、促进种子代谢、提高植物净光合速率和水分利用率、促进营养元素吸收、影响植物的抗逆性等。通过叶面喷施纳米材料可提高水稻幼苗对磷的吸收，促进其生长[14]；对水稻叶面喷施纳米硅可降低水稻对重金属的吸收，增强作物的抗氧化能力[15]。作为纳米材料中的一员，ZnO NPs在农业生产中的应用也备受人们关注。ZnO NPs在低浓度下可促进水稻幼苗生长，在高浓度下则会抑制其生长[16]。在研究植物病害防治中发现ZnO NPs对水稻白叶枯病菌具有较强的抗菌活性[17]。方清[18]发现，ZnO NPs可缓解水稻镉胁迫，增加其叶绿素含量及生物量，降低水稻对镉的吸收。ZnO NPs可以吸附砷，缓解砷对水稻的毒害作用，同时提高水稻中锌的含量[19]。Li等[20]研究表明，ZnO NPs对于镉胁迫下水稻幼苗生长有影响，但关于ZnO NPs对铅胁迫的影响鲜见报道。前期试验应用发现，纳米材料对缓解水稻尤其是香稻重金属胁迫具有一定的积极效应。本试验以2个香稻品种作为材料，研究在铅胁迫下进行ZnO NPs浸种对香稻种子萌发、幼苗生长与生理的影响，以期为提高香稻对重金属胁迫的抗逆性提供一定的思路和依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验地点

供试香稻品种为象牙香占和玉香油占，种子均由华南农业大学农学院香稻研究室提供。试验地点设在广东省广州市华南农业大学农学院实验室内。

1.2 试验设计

选取籽粒饱满的香稻种子，用3%次氯酸盐溶液消毒20 min，再用纯水进行冲洗。将已消毒的种子用不同浓度(ck、25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L)的纳米氧化锌溶液，分别记作ck、T 1、T 2、T 3,分别浸种20 h，然后播种在铺有2层滤纸的培养盒中，加入不同质量浓度(ck和300 mg/L)的铅离子处理液，分别记作Pb 0和Pb 300，于25～28 ℃恒温培养箱中培养7 d。

1.3 各项指标测定方法

1.3.1发芽率测定

以胚根长度超过2 mm作为发芽标准，播种后连续7 d，每天中午观察并记录种子发芽情况。

发芽率(%)=(发芽种子数/供试种子数)×100%

1.3.2胚根、胚芽长度测定

在播种后第7天，每个处理随机选取25株长势一致的香稻幼苗，用直尺测量幼苗胚根长和胚芽长。

1.3.3抗逆性指标的测定

在播种后第7天取新鲜香稻样品，将胚芽和胚根分开，分别作为酶样置于液氮中冷冻并放入-80 ℃冰箱中保存用于抗逆指标的测定。抗逆性指标的测定参照Li YZ等[20]的方法进行。称取0.3 g冷冻保存的鲜样，加入pH值为7.8的磷酸缓冲溶液(PBS)3 mL，再加入液氮进行研磨至形成匀浆，在8 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，上清液即为粗酶液。

SOD活性的测定采用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化学还原法，将240 μL的反应液(含pH值为7.8的PBS 150 μL、130 mmol/L 甲硫氨酸溶液 30 μL、750 μmol/L NBT 30 μL、100 μmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物缓冲液 30 μL)用移液枪加入到酶标板中，再加入粗酶液5 μL，最后加入20 μmol/L 核黄素30 μL混合均匀。将酶标板置于4 000 lx下反应20 min后在560 nm处读取吸光值。计算酶活性时以抑制50%NBT光化学还原反应所需酶量作为1 U,表示为U/g(FW)。

POD活性的测定采用愈创木酚法，用移液枪依次往酶标板中加入0.05 mol/L pH值为7.0的PBS 100 μL、粗酶液5 μL、0.2%愈创木酚95 μL和0.3% H2O2100 μL，充分混合，在470 nm处每隔30 s测量一次吸光值，共测5次。计算酶活性时以每分钟内A470减少0.01作为1 U，表示为U/g(FW)。

CAT活性的测定采用紫外吸收法，用移液枪依次往石英比色皿中加入超纯水1.95 mL、0.3% H2O21.0 mL和粗酶液0.05 mL迅速摇匀，以纯水为对照，在240 nm处每隔30 s测量一次吸光值，共测5次。以每分钟内A240减少0.01作为1 U，表示为U/g(FW)。

MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)氧化法，用移液枪往2 mL离心管中加入粗酶液0.2 mL，再加入0.5% TBA 0.4 mL，充分混匀后沸水浴30 min。在3 000 r/min条件下离心15 min。取上清液,分别在450 nm、532 nm和600 nm处测量吸光值,单位为μmol/g。

1.4 数据处理

使用SPSS Statistics 26和Microsoft Excel 2010数据分析软件对试验数据进行整理分析，并用Origin 2021软件作图。试验数据采用最小显著差异法(LSD)(p<0.05)进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 ZnO NPs浸种对铅胁迫下种子发芽率的影响

由表1可见，在Pb 0条件下，与ck相比，T 1、T 2、T 3处理均显著提高了播种后1 d的象牙香占的发芽率，增幅分别为204%、213%和233%；T 2处理显著提高了播种后1 d的玉香油占的发芽率，增幅为56%；T 1、T 2处理显著降低了播种后2 d的玉香油占的发芽率。

表1 ZnO NPs浸种对铅胁迫下种子发芽率的影响Table 1 Effects of soaking seeds with ZnO NPs under Pb stress on germination rate

在Pb 300条件下，与ck相比，T 1、T 2、T 3处理均显著提高了播种后1 d的玉香油占的发芽率，增幅分别为111%、169%和74%；T 3处理显著降低了播种后3 d的玉香油占的发芽率。在T 3条件下，Pb 0处理和Pb 300处理均显著提高了播种后2 d的象牙香占的发芽率，增幅分别为15%和18%。在播种后4 d，Pb 300处理和T 1处理下象牙香占和玉香油占的发芽率均最高，分别为98.53%和95.31%。结果表明，前期香稻种子发芽受ZnO NPs浸种影响，最终发芽无明显差异。

2.2 ZnO NPs浸种对铅胁迫下种子根和芽形态特征的影响

由表2可知，在Pb 0条件下，与ck相比，T 2处理显著提高了玉香油占的根长，增幅为10.96%。在Pb 300条件下，与ck相比，T 3处理显著降低了象牙香占的根长；T 1、T 3处理显著提高了象牙香占的芽长和玉香油占的根长，增幅分别为12.94%和9.86%、22.26%和25.81%；T 3处理显著降低了玉香油占的芽长。

表2 ZnO NPs浸种对铅胁迫下种子根和芽形态特征的影响Table 2 Effects of soaking seeds with ZnO NPs under Pb stress on morphological characteristics of seed root and shoot

2.3 ZnO NPs浸种对铅胁迫下种子芽的SOD活性的影响

由表3可知，在Pb 0条件下，与ck相比，T 1、T 2、T 3处理均降低了玉香油占芽的SOD活性。 在Pb 300条件下，与ck相比，T 1、T 2、T 3处理均降低了象牙香占芽的SOD活性；T 2处理显著提高了玉香油占芽的SOD活性，增幅为87.52%。在T 3条件下，Pb 0处理和Pb 300处理均降低了2个香稻品种芽的SOD活性。

表3 ZnO NPs浸种对铅胁迫下种子芽的SOD活性的影响Table 3 Effects of soaking seeds with ZnO NPs under Pb stress on SOD activity in seed shoot

2.4 ZnO NPs浸种对铅胁迫下种子根和芽的POD活性的影响

由表4可知，在Pb 0和Pb 300条件下，T 2和T 3处理均显著降低了象牙香占根的POD活性。在Pb 0条件下，T 3处理均显著降低了2个香稻品种芽的POD活性。

表4 ZnO NPs浸种对铅胁迫下种子根和芽的POD活性的影响Table 4 Effects of soaking seeds with ZnO NPs under Pb stress on POD activity in seed root and shoot

2.5 ZnO NPs浸种对铅胁迫下种子根和芽CAT活性的影响

由表5可知，在Pb 0条件下，与ck相比，T 2、T 3处理均显著降低了象牙香占根的CAT活性；T 1处理显著提高了象牙香占芽的CAT活性，增幅为60.00%；T 1、T 3处理均显著降低了玉香油占芽的CAT活性；T 2处理显著提高了玉香油占芽的CAT活性，增幅为38.83%。在Pb 300条件下，与ck相比，T 1、T 2、T 3处理均显著降低了象牙香占根的CAT活性；T 2、T 3处理均显著降低了象牙香占芽的CAT活性；T 1、T 2、T 3处理均显著降低了玉香油占芽的CAT活性。

表5 ZnO NPs浸种对铅胁迫下种子根和芽CAT活性的影响Table 5 Effects of soaking seeds with ZnO NPs under Pb stress on CAT activity in seed root and shoot

2.6 ZnO NPs浸种对铅胁迫下发芽香稻种子根和芽MDA含量的影响

由表6可知，在Pb 0条件下，与ck相比，T 1、T 2、T 3处理均显著降低了象牙香占根的MDA含量，降幅分别为28.49%、44.89%和37.37%；T 1、T 2、T 3处理均提高了玉香油占根的MDA含量。在Pb 0条件下，与ck相比，T 1、T 2处理均提高了2个香稻品种芽的MDA含量。在Pb 300条件下，与ck相比，T 1、T 2、T 3处理均降低了2个香稻品种根以及芽的MDA含量，降幅分别为9.13%～18.26%、2.31%～14.51%和14.28%～21.53%、4.89%～16.50%。

表6 ZnO NPs浸种对铅胁迫下种子根和芽MDA含量的影响Table 6 Effects of soaking seeds with ZnO NPs under Pb stress on MDA content in seed root shoot

注：3 d表示播种后3 d发芽率；SOD表示芽的超氧化物歧化酶活性；4 d表示播种后4 d发芽率；RMDA表示根的MDA含量；RPOD表示根的过氧化物酶活性；RCAT表示根的过氧化氢酶活性；2 d表示播种后2 d发芽率；1 d表示播种后1 d发芽率；SPOD表示芽的过氧化物酶活性；SCAT表示芽的过氧化氢酶活性；SL表示芽长；RL表示根长；SMDA表示芽的MDA含量。图1 测量指标的相关性分析Fig.1 Correlation analysis of measurement indexes

2.7 测量指标的相关性分析

图1显示了13个形态、生理指标之间的相关性。芽的SOD活性与播种后1 d发芽率、播种后4 d发芽率呈显著正相关关系；根的POD活性与播种后4 d发芽率、根的MDA含量、根的CAT活性呈显著正相关关系；播种后1 d发芽率与芽的POD活性、芽的CAT活性、芽长、根长呈显著正相关关系，与播种后3 d发芽率、根的MDA含量呈显著负相关关系；芽的POD活性与芽的CAT活性、芽长、根长、芽的MDA含量呈显著正相关关系；芽的CAT含量与芽长、根长、芽的MDA含量呈显著正相关关系；芽长与根长、芽的MDA含量呈显著正相关；根长与芽的MDA含量呈显著正相关关系。

3 讨 论

作物生命始于种子的萌发，同时，这也是作物最早接触外界环境并做出反应的阶段[8]。大量研究表明，ZnO NPs是一把双刃剑，对植物生长发育存在积极影响也存在着消极的影响。孙露莹等[21]研究发现，适当浓度(<100 mg/L)纳米氧化锌处理可以促进玉米种子萌发。于敬波等[22]研究纳米氧化锌在0、10、20、50、100、200、1 000 mg/L浓度梯度下对水稻种子吉粳803幼苗生长的影响时发现，纳米氧化锌对水稻种子第7天的发芽率相比对照无明显差异，但其幼苗的根和芽的伸长均受到抑制。本试验中在无铅条件下，T 1、T 2、T 3处理下播种后1 d的象牙香占和玉香油占种子发芽率均较ck高，增幅分别为204%～233%和14%～56%，但最终发芽率与ck相比无明显差异。无铅条件下纳米氧化锌浸种对香稻幼苗的根长和芽长无显著影响。本研究结果与前人研究结果不尽相同，一方面可能是所选植物的不同导致纳米氧化锌处理对其产生的影响有所不同；另一方面是种子萌发主要营养来源于种子本身，且纳米氧化锌不易通过种皮进入胚中，所以种子发芽率受纳米氧化锌的影响小，与于敬波等[22]的结果一致。但在幼苗生长阶段，纳米氧化锌可以通过植物的根部吸收进入胚中，对植物生长起作用，所以猜测纳米氧化锌对水稻幼苗生长的作用可能与所选的水稻品种本身有关[23]。本试验结果显示，在铅胁迫下，不同浓度纳米氧化锌浸种对发芽率没有影响。T 1处理和T 3处理下象牙香占的芽长和玉香油占的根长显著高于ck，表明纳米氧化锌浸种缓解了铅对水稻幼苗根系和芽生长的毒害，但该效果存在品种间和生长部位的差异。

铅胁迫会引起植物体内活性氧(ROS)的生成，ROS水平的动态平衡被打破，而酶促抗氧化系统中的SOD、POD和CAT等抗氧化酶在一定范围内能清除细胞中过多的ROS，以维持细胞内ROS平衡，防止膜结构遭受损伤[24-25]。SOD能将O2-氧化成H2O2和O2；POD以愈创木酚作为电子供体清除H2O2；CAT分解呼吸作用和β-氧化过程中脂肪酸产生的H2O2[26]。MDA是植物体内膜脂发生过氧化反应的最终产物之一，可作为衡量质膜受损程度的指标，MDA含量越高则说明体内膜脂过氧化程度越高，膜系统的完整性越差[27]。本试验中无铅条件下，与ck相比，两个香稻品种的POD活性、SOD活性、CAT活性均有所变化，但象牙香占芽的MDA含量以及玉香油占根和芽的MDA含量均有所增加。试验结果表明，纳米氧化锌浸种对香稻幼苗有一定的抑制作用。推测3种抗氧化酶活性降低可能是纳米氧化锌胁迫造成了一定的胁迫，使得香稻细胞内产生大量ROS，且ROS积累量超出了抗氧化酶调节能力的阈值。过量的ROS破坏了抗氧化酶的表达系统和结构，从而导致酶活性降低[28]。本研究结果显示，在铅胁迫下纳米氧化锌浸种处理使两个香稻品种的3种酶(SOD、POD、CAT)活性和MDA含量降低了，可能是纳米氧化锌浸种减缓了铅对香稻幼苗的毒害作用，其机制一方面可能是ZnO NPs吸附铅离子从而减少植物根系从环境中吸收铅的量，另一方面可能是由于纳米氧化锌通过植物细胞的吞噬或胞饮等内吞作用进入植株体内，然后提高了细胞内谷胱甘肽过氧化酶活性，从而促进谷胱甘肽与O2、.OH-和O2-.等发生反应生成氧化型谷胱甘肽，以减少ROS含量，进而减少膜的损伤，最终减轻了铅对香稻幼苗的毒害作用[29-33]。

4 结 论

纳米氧化锌浸种处理对缓解铅胁迫下香稻种子萌发和苗期生长有一定效果，其缓解效果存在品种效应，且香稻幼苗不同部位的生理响应也存在一定的差异。象牙香占在25 mg/L纳米氧化锌浸种下对铅胁迫的缓解效果最好，而玉香油占则是在50 mg/L纳米氧化锌浸种下对铅胁迫的缓解效果最佳。