不同连作年限烤烟根际红壤微生物多样性比较

曹超逸， 潘义宏， 冀新威， 黄 坤， 李柘锦， 张加研

(1.西南林业大学化学工程学院，云南昆明 650224； 2.云南省烟草公司红河州公司，云南弥勒 652300)

烤烟作为云南重要的经济作物，近年来由于耕地资源短缺、其他经济作物影响等导致种植区域不断压缩，连作现象愈加严重。长期连作的烟田土壤理化性状恶化、微生物群落结构失衡等，加剧了烤烟土传病害发生和降低了烟叶产质量，严重制约烟草产业可持续稳定发展。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，参与土壤中物质转化、养分循环利用等，对土壤肥力形成、土壤健康和生态稳定具有关键作用。研究表明，长期连作降低了土壤微生物结构和功能多样性，尤其土壤微生物功能多样性丰富度指数、香农指数等呈现降低趋势，且与轮作差异达到显著水平。土壤细菌群落连作5年后多样性和相对丰度开始降低，并随连作年限的延长，群落丰度、多样性和特有细菌数呈递减趋势；同时连作造成了土壤中病原真菌(被孢霉科、镰刀菌属、链格孢属等)增加，加上自毒物质积累，破坏了土壤微生态平衡，降低土壤功能，引起严重的连作障碍。

土壤微生物多样性可揭示土壤微生物群落的结构和功能的差异，尤其根际微生物与植株和周围土壤之间发生着各种关系，根际微生物的数量、种类等相互作用决定着烟株健康。目前，关于烟草连作对土壤微生物多样性的研究报道主要集中在土壤细菌群落和真菌群落多样性方面，而对于红壤烟区根际土壤微生物群落多样性、种群变化以及与连作年限相关性等方面的研究还较为欠缺。因此，笔者采用Illumina Miseq 高通量测序技术开展了云南省红河红壤烟区不同连作年限的烟田根际土壤微生物多样性研究，分析连作下根际土壤微生物群落丰度和结构组成多样性的变化，挖掘连作下根际红壤微生物功能和群落相关性，有助于进一步了解红河红壤烟区连作烟田根际土壤微生物变化特点，为该地区种植烤烟过程中的微生物调控以及栽培管理提供理论依据和实践指导，促进烤烟产业可持续发展。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2019年在云南省红河州泸西县白水镇大孟泽村(103°30′E，24°46′N)开展，年平均气温15.2 ℃，海拔1 803 m，年平均降水量950 mm，植烟土壤为红壤，试验地块土壤基本理化性质如下：pH值为6.67，有机质含量为30.12 g/kg，全氮含量为1.42 g/kg，全磷含量为1.23 g/kg，全钾含量为 6.30 g/kg，速效氮含量为42.13 mg/kg，速效磷含量为51.46 g/kg，速效钾含量为479.68 g/kg。

1.2 试验设计

在同一连片的地块，分别选取轮作(SCR，种植烤烟前一年种植玉米)、连续种植烤烟2年(SCC2)、3年(SCC3)、4年(SCC4)、5年(SCC5)的地块，并以同连片地块撂荒3年地块为对照(SCK)作为试验小区，每个小区3个重复，每个重复300株烤烟，连续种植烤烟地块烤烟收获后冬闲处理，次年连续种植烤烟。所有处理采用膜下小苗的移栽方法于同一天进行移栽，各处理纯氮用量统一为105 kg/hm，统一移栽时按75 kg/hm进行环施复合肥(N ∶PO∶KO=12 ∶8 ∶25)，第1次追肥按30 kg/hm浇施复合肥(N ∶PO∶KO=12 ∶8 ∶25)，第2次追肥按 150 kg/hm浇施硫酸钾(KO≥52%)。烤烟其他管理措施统一参照红河州烟草公司优质烟叶生产技术措施进行。

1.3 根际土壤样品采集

各处理统一于烤烟现蕾期参照Smalla等的方法，将烤烟全株挖出，并将烟草根放入无菌袋中，用力摇晃，每个重复土样由3个土样组成。及时用冷藏箱将土壤带回实验室，剔除石块和烤烟残根等杂物后过1 mm筛，采用干冰保存的方式送样进行高通量测序。

1.4 检测方法

使用PowerSoil DNA Isolation Kit (Qiagen，Hilden，Germany)试剂盒提取每个样品根际土壤总DNA。用引物338F(5′-A C T C C T A C G G G A G G C A G C A-3′)、806R(5′-G G A C T A C H V G G G T W T C T A A T-3′)对土壤细菌16S rRNA的V3-V4区域进行PCR扩增。用引物ITS1F(5′-C T T G G T C A T T T A G A G G A A G T A A-3′)和引物ITS2(5′-G C T G C G T T C T T C A T C G A T G C-3′)和对土壤真菌ITS区域进行PCR扩增。PCR扩增后，用PCR纯化试剂盒(Omega，USA)纯化产物，在北京百迈客生物科技有限公司采用Illumina HiSeq 2500测序仪(Illumina Inc.，San Diego，USA)进行高通量测序。

1.5 数据处理

测序结束后，原始标记在重叠之后与FLASH合并。用Trimmomatic(Version 0.33)删除低质量标签，用UCHIME(Version 4.1)删除嵌合物。将符合条件的序列以97%的相似度划分到操作分类单元(OTU)中。高通量测序数据的图由R软件生成(Version 2.15.3)。采用Qiime 软件(Version 1.7)进行主成分(PCoA)分析，SPSS 21.0 进行相关性分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 根际土壤微生物区系α多样性分析

2.1.1 根际土壤细菌群落α多样性分析 通过对不同种植年限烤烟根际土壤细菌α多样性进行分析发现，随着种植年限的延长，烤烟根际土壤细菌群落α多样性呈升高—降低—升高—降低趋势(图1-A)。与SCK(撂荒地)相比，种植1年(SCR)烤烟ACE、Chao1、Shannon指数升高，种植2年(SCC2)、种植3年(SCC3)烤烟的ACE、Chao1、Shannon指数下降，种植4年(SCC4)ACE、Chao1、Shannon指数上升，种植5年(SCC5)后的ACE、Chao1、Shannon指数有呈下降趋势。

从ACE指数来看(图1-B)，种植1年(SCR)烤烟的ACE显著高于撂荒地(SCK)、SCC2、SCC3、SCC5(<0.05)，SCK、SCC2、SCC3、SCC5之间无显著性差异(>0.05)。从Chao1指数来看(图1-C)，SCR处理Chao1显著高于SCK、SCC2、SCC5(<0.05)，SCC4处理Chao1显著高于SCK、SCC5、SCC2(<0.05)，与其他种植年限间无显著性差异(>0.05)。从Shannon指数来看(图1-D)，SCC4显著高于SCC5，其他种植年限间差异不显著(>0.05)。

2.1.2 根际土壤真菌α多样性分析 对不同种植年限烤烟根际土壤真菌α多样性进行分析发现，随着种植年限的延长，烤烟根际土壤真菌群落呈波动变化，ACE、Chao1指数呈升高—降低—升高—降低趋势，Shannon指数呈降低—升高—降低趋势(图2-A)。其中SCK的ACE、Chao1指数最低，Shannon指数最高。随着种植年限延长，SCR处理土壤的ACE、Chao1升高，Shannon指数降低，SCC2、SCC3处理土壤的3个指数均持续下降，SCC4处理土壤的3个指数均上升，但SCC5处理土壤的3个指数均呈下降趋势。

从ACE指数来看(图2-B)，SCC4的ACE指数最高，显著高于SCC5和SCC2(<0.05)，SCC5显著高于SCC2(<0.05)，其他处理之间无显著性差异(>0.05)。从Chao1指数来看(图2-C)，不同年限间差异较大，其中SCC4最高，显著高于SCK、SCC2、SCC5(<0.05)，其次是SCC5，显著高于SCK(<0.05)，其他处理间无显著差异(>0.05)。从Shannon指数来看(图2-D)，SCK最高，显著高于SCC3(<0.05)，其次为SCC4，显著高于SCC3(<0.05)，其他年限间无显著性差异(>0.05)。

2.2 根际土壤微生物区系β多样性分析

2.2.1 根际土壤细菌群落β多样性分析 不同种植年限烤烟根际土壤细菌分别在轴(38.05%)、轴(9.93%)和轴(20.26%)可以较好地聚合(图3-A)，表明分析结果较好。SCC2、SCC3能够与其他种植年限根际细菌群落明显区分，SCK、SCR、SCC4、SCC5根际细菌群落没有明显分离。通过置换多元方差(Permanova)分析发现(图3-B)，6个种植年限处理间根际土壤细菌群落存在极显著差异(=0.732，<0.01)，烤烟种植年限对根际细菌群落β多样性影响较大，其中SCC3和SCC2处理与其他4个处理土壤细菌群落组成差异达到极显著水平(<0.01)，说明不同样本微生物群落结构相似性较低，短期的连续种植(2年和3年)使土壤具有明显的细菌群落结构。SCC4、SCR土壤细菌群落组成无显著差异，说明2个处理细菌群落结构相似性较高。

2.2.2 根际土壤真菌群落β多样性分析 不同种植年限烤烟根际土壤真菌分别在轴(15.48%)、轴(9.25%)和轴(13.71%)可以较好地聚合(图4-A)，表明分析结果较好。SCK能够与其他种植年限根际真菌群落明显区分，其他种植年限根际真菌群落没有明显分离，聚合效果较好。通过Permanova分析发现(图4-B)，6个种植年限处理间根际土壤真菌群落存在极显著差异(=0.520，<0.01)，烤烟种植年限对根际真菌群落β多样性影响较大，其中SCK处理与其他5个处理土壤真菌群落组成差异达到极显著水平(<0.01)，说明SCK与其他5个处理土壤真菌群落结构相似性较低， 撂荒处理(SCK)能使土壤具有明显的真菌群落结构。

2.3 根际土壤微生物群落组成分析

2.3.1 根际土壤细菌群落组成分析 分析所测样品细菌TOP10门水平丰富度(图5-A)可知，不同种植年限烤烟根际细菌门水平存在差异。随着种植年限增加，变形菌门明显富集，以SCK最低，为30.63%，SCC4最高，达到41.73%。放线菌门和绿弯菌门呈降低趋势，SCK最高(分别为21.96%和10.03%)，SCC5最低(8.17%和5.75%)。

从TOP10属水平(图5-B)来看，各处理TOP10的优势细菌菌属相对丰度累积总和在17.45%～38.96%，其中SCC3处理最低(17.45%)，SCR处理最高(43.93%)。与SCK处理相比，除SCC3处理外，其他4个处理均能提高根际土壤TOP10的优势细菌菌属相对丰度。其中硝化螺旋菌属、鞘脂单胞菌属、芽单胞菌属、不可培养Subgroup_6菌属、MND1菌属在不同种植年限间富集差异明显。说明种植植物后能提高土壤细菌的相对丰度。随着种植年限增加SCC3中硝化螺旋菌属和不可培养Subgroup_6菌属明显下降，该处理下属水平细菌菌属相对丰度累积总和下降明显，仅为17.45%，而 SCC4中属水平细菌相对丰度累积总和明显增加，达到36.98%。

2.3.2 根际土壤真菌群落组成分析 分析6个处理中TOP10门水平真菌组成(图6-A)，6个处理优势真菌均为子囊菌门。TOP10的优势细菌菌门相对丰度累积总和随着种植年限增加呈下降-升高的变化趋势，其中SCK处理最高，达到83.45%，SCR下降到65.91%，随着种植年限的增加呈增加的趋势，于SCC4达到最高(77.63%)，SCC5丰富度略有降低(74.40%)。SCR中被孢霉门和壶菌门相对丰度最高，分别为11.05%和7.70%，明显高于其他处理。

分析6个处理中TOP10属水平真菌分布(图6-B)，各处理TOP10的优势真菌菌属相对丰度累积总和在14.46%～43.93%，其中SCK处理相对丰度最低(14.46%)，SCC3处理最高(43.93%)。与SCK处理相比，不同处理均能提高根际土壤TOP10的优势真菌菌属相对丰度。说明种植植物能提高土壤真菌的相对丰度。其中SCR处理中被孢霉属丰度最高，达到11.01%；SCC2处理中小不整球壳属丰度最高，达到15.25%；SCC3处理中枝鼻菌属、黑蛋巢菌属和毛葡孢属丰度最高，分别达到17.24%、11.35%和8.21%；SCC4处理中裂壳属和曲霉菌属丰度最高，分别达到6.45%和6.27%；SCC5中镰刀菌属富集明显，丰度最高，达到10.01%，明显高于其他处理。

2.4 根际土壤细菌和真菌群落相关性分析

对不同种植年限与烤烟根际土壤微生物群落相关性(表1)进行分析，细菌群落多样性指数与烤烟种植年限均无显著相关性(>0.05)，但细菌门水平的酸杆菌门、绿弯菌门与种植年限呈显著负相关(<0.05)，疣微菌门与种植年限呈显著正相关(<0.05)。属水平中的苔藓杆菌属、RB41菌属与种植年限呈显著负相关(<0.05)。真菌多样性指数、真菌门水平和属水平与种植年限无显著相关性(>0.05)。

3 讨论与结论

土壤中的微生物在土壤中扮演着主要的角色，受种植模式、 养分、水分等外界环境影响较大，其群落的多样性和结构组成的稳定性是土壤生态系统健康的重要指标之一。土壤微生物多样性的降低会直接造成土传病害发病率增加，而丰富的微生物多样性有利于促进作物根系的生长发育，同时提高作物对土传病害的抑制率。

表1 烤烟种植年限与根际微生物群落相关性分析

研究中土壤微生物群落的α多样性呈升高—降低—升高—降低的变化趋势，其中轮作种植处理(SCR)土壤细菌ACE和Chao1显著高于其他处理，说明轮作能有效提高土壤细菌群落多样性。SCC4处理土壤真菌ACE和Chao1最高，显著高于其他处理，说明持续长期连作(SCC4)土壤微生物群落多样性有恢复的趋势，但在SCC5处理下又呈现降低的趋势，可能与连作根际土壤微生物适应胁迫条件下生态环境能力不断增强有关。但随着连作时间继续延长(SCC5)，可能会导致土壤中自毒物质的积累，促进有害微生物的繁殖，从而降低微生物多样性，具体的原因需要进一步进行试验验证。

PCoA分析结果表明，短期连作(SCC2、SCC3)土壤细菌与SCK、SCR以及长期连作样品明显分离，撂荒地块(SCK)土壤真菌与其他处理明显分离，说明短期连作能使土壤有明显的细菌群落结构，而撂荒处理能使土壤具有明显的真菌群落结构。这与敖金成等的研究结果一致。所有样品中细菌确定的优势门为变形菌门，其次为酸杆菌门和放线菌门，这与以往的报道一致，但这些门在不同连作年份测量的相对丰度存在差异。TOP10的细菌相对丰度累积总和呈升高—降低—升高的趋势。而真菌优势菌属随着种植年限的增加呈升高趋势，并在SCC3处理达到最高，之后又逐渐降低。与其他处理相比，轮作(SCR)土壤中真菌的被孢霉门和壶菌门富集明显，相对丰度分别达到11.05%和7.70%，担子菌门丰富度较低，仅为1.20%，研究表明，被孢霉门大部分微生物为有益菌，在土壤中具有解磷、解氮的功能，同时还具有促进植物生长的作用。壶菌门的大部分微生物种属能分解土壤中的几丁质和维生素，促进土壤碳氮循环和作物的生长。而担子菌门微生物是大部分作物病害的病原菌，如立枯病和白粉病等。说明与不同连作年限烤烟相比，轮作有利于提高有益菌的相对丰度，降低有害微生物的丰度。从真菌属来看，SCC5中镰刀菌属丰度最高，达到10.01%。镰刀菌属包含多种病原真菌，如串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、黄色镰刀菌等会侵染作物，造成病害。这可能也是长期连作会造成病害频发的主要原因之一。

研究中根际土壤细菌门水平酸杆菌门和绿弯菌门与种植年限呈显著负相关(<0.05)，而疣微菌门与种植年限呈显著正相关(<0.05)。酸杆菌门在土壤中细菌群落中有较高的占比，是一类新划分的细菌门，一般能占到土壤总细菌的20%～50%，尤其在酸性、养分较低的土壤中有较高的丰度，在土壤环境构建和物质循环中起着关键作用。而绿弯菌门也是土壤环境构建过程中重要的参与者，广泛参与了碳、氮、硫等元素在土壤环境中的循环。随着烤烟种植年限的增加，这2类有益菌明显减少，这可能是连作打破土壤微环境平衡，造成连作障碍的主要原因之一。而相关研究也发现，疣微菌门在土壤碳循环过程中起着较为重要的作用。近年的研究也发现该门细菌中的一些成员和其他有益细菌可以在玉米根际土壤与根系建立有益的微生物-植物的相互作用，其相对丰度与玉米的农艺性状和钾含量呈显著正相关关系。但本研究中，各处理疣微菌门在TOP10细菌中的相对丰度最小，均未超过2.6%，因此可以推断该类群细菌虽然随着种植年限增加而增加，但对烤烟的正向影响有限。在属水平上，酸杆菌门中的苔藓杆菌属、RB41菌属与种植年限呈显著负相关(<0.05)。苔藓杆菌属细菌在土壤中能分解木质素和纤维素等有机质，有助于改善土壤环境。最近的研究发现RB41菌属、根瘤菌属和链霉菌属等3个细菌属通过细菌生产力和呼吸共同构成了45%～57%的碳流通，在生态系统中属于重要的特定关键类群。研究中随着种植年限的增加，苔藓杆菌属、RB41菌属明显减少，这可能是造成连作土壤微环境失衡的重要原因。Banerjee 等研究指出，微生物多样性是评价土壤的重要指标，但土壤中一些起着重要作用的关键微生物类群也是评价土壤健康的重要指标，针对不同的需求，深入研究土壤微生物关键类群具有重要意义。研究中酸杆菌门、绿弯菌门、疣微菌门以及苔藓杆菌属、RB41菌属可以作为连作烤烟土壤的关键菌群，可为连作烤烟红壤微环境健康的判断提供科学依据。

随着种植年限的增加，现蕾期烤烟根际土壤微生物群落的ACE、Chao1呈升高—降低—升高—降低的变化趋势，且各处理间根际土壤微生物群落β多样性均存在极显著差异(<0.01)，短年限种植(SCC2和SCC3)能使土壤具有明显的细菌群落结构，撂荒处理(SCK)能使土壤具有明显的真菌群落结构。细菌门水平中的酸杆菌门和绿弯菌门与种植年限呈显著负相关(<0.05)，疣微菌门与种植年限呈显著正相关(<0.05)；属水平中的苔藓杆菌属、RB41菌属与种植年限呈显著负相关(<0.05)；6个处理优势真菌门均为子囊菌门，属水平的镰刀菌属微生物在连续种植5年处理丰度最高，达到10.01%，这几类微生物的相对丰度可以作为评价红河烟区连作烤烟红壤微环境健康的关键门属。