磷脂型二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸对脂多糖所致小鼠急性肝损伤的保护作用及机制

黄玉洁，郝仪铭,2，周梦晴，伍梓健，杨玉红，刘小芳，王保珍，杜 磊,2,*

（1.山东大学齐鲁医学院公共卫生学院，山东 济南 250012；2.山东大学附属济南市中心医院专科转化研究中心，山东 济南 250013；3.齐鲁工业大学（山东省科学院）食品科学与工程学院，山东 济南 250353；4.中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业农村部极地渔业开发重点实验室，山东 青岛 266071）

肝脏作为人体最大的实质器官，具有分泌胆汁、代谢、凝血、解毒和免疫等功能，在维持人体健康生理活动中起至关重要的作用。病毒感染、氧化应激、酒精、药物等多种因素可导致急性肝损伤，严重者甚至发展为肝衰竭，造成重大健康威胁。因此，寻找新的并且安全有效的肝损伤保护食品功能因子具有重要意义。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，在急性肝损伤的发生、发展过程中起重要作用。因此，LPS诱导的急性肝损伤动物模型常被用来探寻能有效防治急性肝损伤的干预措施。

海洋食品富含-3系多不饱和脂肪酸，特别是二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），二者具有抗炎、改善糖脂代谢、促进视觉和神经系统发育等多种生物活性。不同海洋食品中DHA和EPA存在的分子形式不同，南海鸢乌贼（）属于鞘亚纲、枪形目、柔鱼科，其生命周期短、生长率高、繁殖力强，是一种极具开发潜力的头足类海洋渔业资源。我国南海海域鸢乌贼资源丰富，其高值化加工利用是当前的热点问题。冰岛刺参（）属于海参纲、枝手目、瓜参科，是我国市场上消费量较大的低值海参品种。课题组前期研究发现，南海鸢乌贼卵以及冰岛刺参体壁中分别富含磷脂型DHA（DHA-enriched phospholipids，DHA-PL）和磷脂型EPA（EPA-enriched phospholipids，EPA-PL），且其对高脂饮食所致代谢综合征具有良好预防作用。与其他分子形式DHA和EPA相比，DHA-PL和EPA-PL的生物利用率更高，且具有更好的抗氧化稳定性。然而，目前鲜见DHA-PL和EPA-PL对LPS诱导的急性肝损伤影响的报道。因此，本研究考察DHA-PL和EPA-PL对LPS所致小鼠急性肝损伤的保护作用并初步分析其分子机制，以期为南海鸢乌贼和冰岛刺参的高值化利用以及开发具有保肝护肝功效的新型海洋食品功能因子提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性6 周龄健康C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）2020-0022。

南海鸢乌贼和冰岛刺参 青岛市南山水产市场；LPS 美国Sigma-Aldrich公司；天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒 南京建成生物工程有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒（增强型）和动物组织RNA提取试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；小鼠肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 美国R&D Systems公司；逆转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒 日本TaKaRa公司；丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）如细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（phosphorylated-ERK1/2，p-ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化JNK（phosphorylated-JNK，p-JNK）、p38、磷酸化p38（phosphorylated-p38，p-p38）、核因子（nuclear factor，NF）-κB p65、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated-NF-κB p65，p-NF-κB p65）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）以及山羊抗兔免疫球蛋白G辣根过氧化物酶标记二抗 美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 仪器与设备

BSA224S-CW电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；5430R离心机 德国Eppendorf公司；Bioprep-24R制冷型生物样品均质仪 杭州奥盛仪器有限公司；Excelsior AS全自动组织脱水机、CTM6石蜡封片机和Gemini AS自动玻片染色机 美国Thermo Fisher Scientific公司；EC 350-1包埋机和HM 325切片机德国Microm公司；LightCycler 480实时荧光定量PCR系统 瑞士Roche公司；IX70型倒置荧光显微镜日本Olympus公司；Infinite M200 Pro多功能酶标仪瑞士TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 DHA-PL和EPA-PL的制备

参照课题组前期研究方法分别从南海鸢乌贼卵以及冰岛刺参体壁中提取、分离和纯化DHA-PL和EPA-PL。制备得到的DHA-PL和EPA-PL经高效液相色谱法检测纯度分别为93.7%和92.5%。气相色谱法分析结果显示，DHA-PL中DHA质量分数为38.3%，EPA-PL中EPA质量分数为42.0%。

1.3.2 动物模型的建立和处理

32 只雄性6 周龄C57BL/6J小鼠于SPF级动物实验室饲养，温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%、12 h/12 h光照循环。实验期间小鼠自由饮食饮水。动物实验严格遵照山东大学公共卫生伦理委员会相关规定执行。小鼠适应性饲养1 周后，按随机数字表法分为4 组，每组8 只：正常对照组（Control）、模型组（LPS）、DHA-PL干预组（LPS+DHA-PL）和EPA-PL干预组（LPS+EPA-PL）。《中国居民膳食营养素参考摄入量（2013版）》中将成年人DHA+EPA的宏量营养素可接受范围（acceptable macronutrient distribution ranges，AMDR）定为0.25～2.00 g/d，结合前期实验结果，DHA-PL和EPA-PL分别制备成脂质体并以400 mg/kg剂量连续给予小鼠灌胃28 d，灌胃体积为10 mL/kg。Control组和LPS组小鼠每天按20 mL/kg灌胃生理盐水。第29天时，Control组小鼠经腹腔注射无菌生理盐水，其余小鼠腹腔注射剂量为10 mg/kg的LPS，注射体积为10 mL/kg，建立急性肝损伤模型。6 h后，小鼠摘眼球取血，室温静置30 min后，1 000×、4 ℃离心10 min，分离收集血清备用。随后，小鼠引颈处死，取肝脏并称质量，计算肝指数（肝质量/小鼠体质量×100%），肝脏保存于-80 ℃进行后续实验。

1.3.3 血清ALT和AST活力测定

按对应试剂盒说明书测定小鼠血清ALT和AST活力。

1.3.4 肝组织病理学检查

取小鼠相同部位的肝组织置于10%中性福尔马林溶液固定48 h，经脱水、浸蜡、包埋和切片等步骤制成4 μm厚的石蜡切片，苏木精-伊红染色后于光学显微镜下观察各组小鼠肝组织病理学变化。

1.3.5 实时荧光定量PCR法测定促炎细胞因子mRNA相对表达水平

利用RNA柱式提取试剂盒提取各组小鼠肝组织中总RNA，检测RNA浓度和完整性后取1 μg RNA逆转录合成cDNA。设计合成引物并以cDNA作为模板进行实时荧光PCR扩增。以作为内参，根据2计算基因mRNA相对表达水平。本研究所用引物（表1）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 本研究所用基因引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.6 小鼠肝脏中促炎细胞因子含量的测定

称取0.1 g小鼠肝组织，按1∶9（/）的比例加入预冷生理盐水，在制冷型生物样品均质仪中匀浆，12 000×、4 ℃条件下离心15 min，收集组织匀浆上清液。利用ELISA检测试剂盒分别测定小鼠肝组织上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，并使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测肝组织上清液蛋白质量浓度进行标准化处理。

1.3.7 蛋白免疫印迹法检测蛋白相对表达水平

称取0.1 g小鼠肝组织，加入含蛋白酶/磷酸酶抑制剂和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA裂解液，在制冷型生物样品均质仪中进行组织匀浆，测定蛋白浓度。将蛋白样品高温变性后，经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），湿法转印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-NF-κB p65、NF-κB p65和GAPDH一抗（1∶1 000，TBST稀释），4 ℃孵育12 h，TBST洗涤3 次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，TBST再次洗涤3 次后，通过增强型化学发光试剂（enhanced chemiluminescence，ECL）显色，采用5200 multi全自动化学发光图像处理系统（上海天能科技有限公司）进行图像分析，ImageJ软件进行蛋白条带灰度分析，以GAPDH作为内参，分析目的蛋白的相对表达水平，蛋白的磷酸化水平以磷酸化蛋白与对应蛋白条带灰度的比值表征。

1.4 数据统计与分析

实验结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，采用Tukey’s事后检验进行显著性分析。当＜0.05时，表示组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 DHA-PL和EPA-PL对小鼠体质量、肝质量和肝指数的影响

如表2所示，各组小鼠体质量无显著性差异（＞0.05），但与Control组相比，LPS组小鼠肝脏质量和肝指数极显著升高（＜0.01），但DHA-PL和EPA-PL预防性干预可明显抑制LPS所致小鼠肝质量以及肝指数的增加。

表2 DHA-PL和EPA-PL对LPS处理后小鼠体质量、肝质量和肝指数的影响（n＝8）Table 2 Effects of DHA-PL and EPA-PL on body mass, liver mass and hepatic index in LPS-treated mice (n = 8)

2.2 DHA-PL和EPA-PL对小鼠血清ALT和AST活力的影响

ALT和AST是反映肝损伤最敏感的指标。如图1所示，与Control组相比，LPS组小鼠血清ALT和AST活力极显著升高（＜0.01），而DHA-PL和EPA-PL预防性干预可有效抑制ALT（＜0.01）和AST活力（＜0.01、＜0.05）的升高。

图1 DHA-PL和EPA-PL对LPS处理后小鼠血清ALT（A）和AST（B）活力的影响Fig. 1 Effects of DHA-PL and EPA-PL on serum ALT (A) and AST (B)activities in LPS-treated mice

2.3 DHA-PL和EPA-PL对小鼠肝组织形态学变化的影响

各组小鼠肝组织苏木精-伊红染色结果如图2所示，正常小鼠肝组织形态正常，肝细胞胞质丰富，无病变、无坏死、无炎性细胞浸润，肝小叶结构清晰完整，肝细胞索呈放射状排列。LPS作用6 h后可见小鼠肝组织受损明显，大量炎性细胞浸润。DHA-PL和EPA-PL预防性干预后小鼠肝组织病变较轻，炎性细胞浸润不明显。上述结果提示，DHA-PL和EPA-PL预防性干预可有效保护LPS诱导的小鼠急性肝损伤。

图2 DHA-PL和EPA-PL对LPS处理后小鼠肝组织形态学变化的影响（200×）Fig. 2 Effects of DHA-PL and EPA-PL on hepatic histopathology in LPS-treated mice (200 ×)

2.4 DHA-PL和EPA-PL对小鼠肝脏中促炎细胞因子表达的影响

如图3所示，与Control组相比，LPS组小鼠肝脏中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平和含量极显著升高（＜0.01）；DHA-PL和EPA-PL预防性干预可极显著抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平以及含量的增加（＜0.01）。

图3 DHA-PL和EPA-PL对LPS处理后小鼠肝脏中促炎细胞因子mRNA相对表达水平（A）和含量（B）的影响Fig. 3 Effects of DHA-PL and EPA-PL on mRNA levels (A) and contents (B) of pro-inflammatory cytokines in LPS-treated mice

2.5 DHA-PL和EPA-PL对小鼠肝脏中MAPK和NF-κB信号通路关键蛋白表达水平的影响

MAPK和NF-κB信号通路被认为是介导炎症反应的关键信号通路。蛋白免疫印迹实验结果显示，与Control组相比，LPS组小鼠肝脏中p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK、p-p38/p38及p-NF-κB p65/NF-κB p65极显著上调（＜0.01）；DHA-PL和EPA-PL预防性干预可有效抑制ERK1/2、JNK、p38以及NF-κB p65蛋白的磷酸化（图4）。上述结果提示DHA-PL和EPA-PL可能通过抑制MAPK和NF-κB信号通路的激活改善LPS诱导的肝组织炎症反应。

图4 DHA-PL和EPA-PL对LPS处理后小鼠肝脏中MAPKs和NF-κB信号通路关键蛋白表达水平的影响Fig. 4 Effects of DHA-PL and EPA-PL on protein expression of key factors involved in MAPKs and NF-κB signaling pathways in LPS-treated mice

3 讨 论

急性肝损伤是以肝功能迅速恶化为临床特点的急性综合征，严重者会出现肝脏大面积坏死甚至肝衰竭，病死率较高。研究表明，肠道来源的内毒素是造成肝功能损伤的重要因素，在LPS刺激下，肝窦状隙内的枯否细胞发生M1型极化，可分泌大量促炎细胞因子，导致肝细胞损伤，并可分泌趋化因子招募中性粒细胞和单核细胞进入肝脏，进一步加重炎症介导的肝损伤。

南海鸢乌贼卵和冰岛刺参体壁富含DHA和EPA，且主要结合在甘油磷脂的-2位上，磷脂在小肠中被磷脂酶A催化释放游离型DHA和EPA以及溶血磷脂，溶血磷脂在小肠细胞中重新合成磷脂，被机体吸收利用。研究发现，-3系多不饱和脂肪酸和磷脂具有护肝作用，但鲜见DHA-PL和EPA-PL对急性肝损伤影响的报道。因此，本研究通过腹腔注射LPS模拟急性肝损伤的病理过程，考察DHA-PL和EPA-PL对急性肝损伤是否具有保护作用。当肝组织受损时，肝细胞膜结构被破坏，通透性增加，导致肝细胞中ALT和AST大量释放入血，从而使血清中ALT和AST活力升高。通过比较各组小鼠血清中ALT和AST活力发现，DHA-PL和EPA-PL预防性干预可显著降低LPS暴露引起小鼠血清ALT和AST活力的升高（＜0.01、＜0.05），提示DHA-PL和EPA-PL能有效缓解LPS诱导的肝细胞损伤。肝组织病理学结果显示，DHA-PL和EPA-PL预防性干预可明显减少LPS诱导的小鼠肝细胞中炎性细胞浸润，保护肝组织结构正常。促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等作为反映炎症水平的指标，在急性肝损伤进程中发挥重要作用。本研究结果发现，DHA-PL和EPA-PL预防性干预可明显下调LPS诱导的小鼠肝脏中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平和含量的升高，且其效果相近。上述结果提示，DHA-PL和EPA-PL可有效降低LPS诱导的急性肝损伤小鼠肝脏的炎症水平。

MAPKs是哺乳动物细胞内广泛存在的一类丝、苏氨酸蛋白激酶，目前研究最广泛的是ERK1/2、JNK和p38。LPS可激活ERK1/2、JNK和p38，导致核转录因子激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）活化后进入细胞核，进而促使肝组织中枯否细胞释放大量炎症介质，诱发炎症反应。NF-κB是炎症反应中另一个重要的转录调节因子，LPS可诱导其活性亚基p65进入细胞核，促使细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子大量释放，随后进一步活化NF-κB，形成炎症“瀑布效应”，加重肝损伤程度。本研究结果表明，LPS可诱导小鼠肝脏中ERK1/2、JNK、p38以及NF-κB p65磷酸化水平上升，DHA-PL和EPA-PL预防性干预可有效降低小鼠肝脏中上述蛋白的磷酸化水平。该结果提示DHA-PL和EPA-PL可能通过阴断MAPK和NF-κB信号通路的激活进而发挥其对LPS诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用。另外，本研究发现DHA-PL和EPA-PL保护LPS所致小鼠急性肝损伤的效果大致相同，这或许与虽然DHA对促炎细胞因子的抑制作用更加广泛，但EPA-PL的消化吸收速率慢于DHA-PL，可使动物血液中EPA长时间维持在较高水平有关。

综上，DHA-PL和EPA-PL均可有效保护LPS所致急性肝损伤，保护效果接近，且其抗炎保肝作用依赖于其对MAPK和NF-κB信号通路的调控。本研究结果为南海鸢乌贼和冰岛刺参等水产品的高值化利用以及开发具有保肝护肝的新型保健食品提供了理论基础。