小麦肽改善慢性疲劳综合征大鼠认知功能障碍

刘 辉，周安妮，胡胜男，陈 宁，秦 智，贾绍辉,*

（1.武汉体育学院健康科学学院，运动训练监控湖北省重点实验室，天久运动营养食品研发中心，湖北 武汉 430079；2.武汉体育学院研究生院，湖北 武汉 430079）

慢性疲劳综合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是一种至少持续6 个月，以严重身体和脑疲劳为主要表现的综合征候群，常伴随睡眠障碍、短期记忆力减退、注意力下降、头痛、关节痛等症状。与一般性疲劳有所区别的是，充分休息并不能很好缓解CFS患者的临床症状，且目前尚无针性的CFS标准治疗方法，常用治疗手段主要包括增强免疫能力的药物治疗，营养平衡疗法，改善认知行为的治疗、局部物理治疗以及分级运动疗法等。已有研究表明CFS患者普遍存在认知功能障碍，因此靶向改善认知功能障碍的治疗方法被认为有助于缓解CFS症状。

最近的研究结果提示合适的营养补充可能是CFS的有效干预手段。小麦肽是利用现代酶解技术酶解小麦蛋白而获得的一种小分子混合肽，诸多研究证实小麦肽具有良好抗氧化、免疫调节以及促进损伤恢复等多种生物学功能。此外，氧化应激的增加和免疫功能低下是诱导CFS发病的两大重要原因，据此推测小麦肽可能具有缓解CFS临床症状的功效。鉴于认知功能障碍是CFS患者常见的临床表现，本实验通过构建CFS大鼠模型，分别口服给予低、中、高剂量小麦肽进行干预，考察小麦肽对CFS模型大鼠认知功能障碍的改善作用，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦肽由山东中食都庆生物技术有限公司制备并提供。

70 只健康雄性SD大鼠购自湖北省三峡大学动物实验中心，生产许可证号：SCXK（鄂）2011-0012，体质量180～220 g。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒 北京索莱宝生物技术公司；色氨酸、5-羟色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）、脑源性神经营养因子（brainderived neurotropic factor，BDNF）以及神经生长因子（nerve growth factor，NGF）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所；白细胞介素4（interleukin 4，IL-4）、IL-10、肿瘤坏死因子β（tumor necrosis factor β，TNF-β）以及干扰素γ（interferon γ，IFN-γ）检测试剂盒、蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF） 上海碧云天生物技术公司。

1.2 仪器与设备

LA8900氨基酸分析仪 日本Hitachi公司；Morris水迷宫（ZS-Morris） 北京众实迪创科技发展有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 小麦肽分子质量和氨基酸组成测定

采用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）测定小麦肽分子质量，采用氨基酸分析仪测定小麦肽氨基酸组成，每种氨基酸含量表示为其在总氨基酸含量中的占比。

1.3.2 实验动物及分组

大鼠适应性喂养1 周后，随机选择10 只大鼠作为正常对照组（N），其余实验大鼠进行CFS造模。造模成功后，将模型大鼠随机分为模型对照组（M）、低剂量小麦肽组（M+L）、中剂量小麦肽组（M+M）以及高剂量小麦肽组（M+H），每组10 只。M+L、M+M以及M+H组实验大鼠分别灌胃给予0.2、0.4、0.8 g/（kg·d）小麦肽，N组与M组大鼠灌胃同等剂量的生理盐水，每天1 次，共8 周。干预结束后，水迷宫实验用于评估大鼠认知功能；水迷宫实验结束后，处死大鼠取外周血，4 ℃、3 000 r/min离心5 min收集血清，采用ELISA法试剂盒检测色氨酸、NGF、BDNF、IL-4、IL-10、TNF-β以及IFN-γ浓度，同时收集实验大鼠新鲜海马组织用于测定SOD活力、MDA和5-HT含量。

1.3.3 CFS模型大鼠构建

采用慢性束缚结合冷水力竭游泳的方式构建CFS大鼠模型。将实验大鼠放入圆柱形塑料筒（筒长18 cm、直径7 cm，前端有一内径为1.5 cm漏斗样通气口）中进行束缚以限制其活动，束缚时间30 min，然后将大鼠转移至游泳缸内进行游泳干预至力竭，力竭判断以头部沉入水中3 s不浮出水面为标准，水温维持18～22 ℃。每天进行1 次上述干预，实验大鼠出现体质量明显减轻、毛发稀疏泛黄、背部皮肤松弛、大便干结或稀溏、精神萎靡不振、活动减少以及食欲下降等现象时，认定模型构建成功。

1.3.4 认知功能评估

采用Morris迷宫评估实验大鼠认知功能。干预结束前6 d进行适应性训练，训练前先在水池壁标记4 个入水点，将水池划分为4 个象限。然后分别进行定位航行实验和空间探索实验。

定位航行实验：实验前1 d，让大鼠在水池内自由游泳120 s以熟悉环境，实验开始后每天进行5 次训练，依次从4 个象限入水点处面向池壁将大鼠放入池中，记录大鼠爬上平台所用时间，即逃避潜伏期，如果大鼠在120 s内未能爬上平台，则将其引导至平台，并将逃避潜伏期记录为120 s，2 次训练之间休息60 s，共训练5 d。

空间探索实验：定位航行实验结束后，将平台撤除，从第Ⅲ象限入水点处将大鼠放入水中，记录120 s内大鼠穿越平台位置的次数以及在平台象限逗留的时间。

1.3.5 海马组织SOD活力和MDA含量检测

取实验大鼠海马组织40 mg，加入细胞裂解液1 mL、蛋白酶抑制剂PMSF 1 μg，4 ℃下采用组织匀浆机匀浆5 min，然后冰浴超声2 min。处理完毕后样品于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用相应试剂盒测定海马组织中SOD活力和MDA含量。

1.3.6 炎性因子与神经细胞因子水平检测

取1.3.2节收集的实验大鼠血清，采用ELISA试剂盒检测血清色氨酸、NGF、BDNF、TNF-β、IFN-γ、IL-10以及IL-4含量。另取1.3.5节制备的适量海马组织上清液，采用ELISA检测试剂盒检测其中5-HT含量。

1.4 数据处理与分析

实验结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 2.4软件对数据进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 小麦肽分子质量分布

GPC检测结果（表1）表明，小麦肽中分子质量小于1 003 Da的肽占比97.52%，分子质量小于505 Da的肽占比91.05%，分子质量小于270 Da的小肽占比66.28%。

表1 小麦肽分子质量分布Table 1 Molecular mass distribution of wheat peptide

2.2 小麦肽氨基酸组成

氨基酸测序结果（表2）表明，该小麦肽氨基酸总含量为91.98%；小麦肽中含量最高的氨基酸为谷氨酸（Glu），约为34.55%，其次为脯氨酸（Pro），约为10.79%；此外该混合肽中，支链氨基酸（Val、Ile和Leu）含量为14.04%。

表2 小麦肽氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of wheat peptide

2.3 小麦肽对CFS大鼠逃避潜伏期时间的影响

如表3所示，随着训练天数逐渐增加，各实验组大鼠逃避潜伏期时间均呈缩短趋势，且相同训练时间下，CFS模型组实验大鼠逃避潜伏期时间均显著长于正常对照组（＜0.05），经8 周小麦肽干预后，各干预组大鼠的逃避潜伏期时间较CFS模型大鼠均显著缩短（＜0.05），且呈一定的剂量依赖性，但各剂量组间无明显差异。

表3 小麦肽对CFS大鼠逃避潜伏期的影响Table 3 Effect of wheat peptide on escape latency of CFS rats

2.4 小麦肽对CFS大鼠空间探索能力的影响

如表4可知，CFS模型大鼠（M组）穿越平台象限次数与平台象限停留时间较正常对照（N）组均显著减小（＜0.05）。经过8 周口服小麦肽干预后，M+L、M+M及M+H组实验大鼠穿越平台象限次数及平台象限停留时间较CFS模型大鼠均显著增加（＜0.05），虽平台象限停留时间的延长呈一定的剂量依赖性，但组间无明显差异。

表4 小麦肽对CFS大鼠穿越平台象限次数与平台象限停留时间的影响（n＝10）Table 4 Effect of wheat peptide on spatial exploration capacity of CFS rats (n = 10)

2.5 小麦肽对CFS大鼠神经细胞因子分泌的影响

上述实验结果表明，口服小麦肽可显著改善CFS大鼠认知能力，因此进一步评估各实验组大鼠神经细胞因子水平。如图1所示，与正常对照组相比，CFS大鼠外周血中BDNF和NGF质量浓度显著降低（＜0.05），而外周血中色氨酸浓度以及海马组织中5-HT含量则显著上升（＜0.05），经8 周口服小麦肽干预后，CFS大鼠血清中色氨酸和海马组织中5-HT水平均显著下降（＜0.05），外周血中BDNF和NGF质量浓度显著升高（＜0.05），但3 种剂量小麦肽干预组间无显著差异。

图1 小麦肽对CFS大鼠血清中神经细胞因子分泌的影响（n＝10）Fig. 1 Effect of wheat peptide on serum neurocytokines in CFS rats (n = 10)

2.6 小麦肽对CFS大鼠海马组织中氧化应激水平的影响

抗氧化应激能力下降是CFS发病的重要原因，本实验进一步考察口服小麦肽对CFS大鼠氧化应激水平的影响。如图2所示，CFS模型大鼠血清中SOD活力较正常对照组大鼠显著降低（＜0.05），而口服给予低、中、高剂量小麦肽均能显著增加CFS大鼠海马组织中SOD活力（＜0.05），且呈一定剂量依赖性，但无显著差异。同样，M组大鼠海马组织中MDA浓度显著高于N组（＜0.05），而M+L、M+M及M+H组实验大鼠海马组织中MDA浓度显著低于M组（＜0.05），但这3 组间比较无显著差异。

图2 小麦肽对CFS大鼠氧化应激水平的影响（n＝10）Fig. 2 Effect of wheat peptide on oxidative stress in CFS rats (n = 10)

2.7 小麦肽对CFS大鼠外周血中Th1型细胞因子向Th2型转化的促进作用

对实验大鼠血清Th1型和Th2型细胞因子水平检测后发现，与正常对照组大鼠相比，CFS模型大鼠血清IL-4和IL-10质量浓度显著增加（＜0.05），而TNF-β以及IFN-γ质量浓度均显著下降（＜0.05）。经8 周口服小麦肽干预后，与M组相比，CFS大鼠血清IL-4和IL-10质量浓度均显著下降（＜0.05）；相反，TNF-β和IFN-γ质量浓度显著上升（＜0.05），但3 种剂量小麦肽干预组间比较无显著差异（图3）。

图3 小麦肽对CFS大鼠血清中Th1型和Th2型细胞因子的影响（n＝10）Fig. 3 Effect of wheat peptide on serum levels of Th1 and Th2 cytokines in CFS rats (n = 10)

3 讨 论

已有研究表明，约有一半CFS患者可受益于营养干预。饮食疗法，包括饮食调整和营养补充可能有助于缓解CFS患者临床症状。认知功能损伤是CFS患者常见的临床症状，因此靶向改善认知功能障碍是CFS重要的临床治疗手段。本研究中，水迷宫实验显示CFS模型大鼠发生明显的认知功能障碍，表现为逃避潜伏时间延长，穿越平台象限次数和平台象限停留时间均显著减少；而在给予不同剂量小麦肽干预8 周后，CFS模型大鼠认知功能障碍得到明显改善。

氧化应激是CFS的重要致病因素，过度的氧自由基毒性与CFS患者认知障碍的发生与发展密切相关。近年的研究结果显示，疲劳患者血清中氧化参数包括MDA和活性氧水平显著增加，而抗氧化SOD、过氧化氢酶活力以及谷胱甘肽含量则显著降低。同样，本研究中慢性束缚结合冷水力竭游泳诱导的CFS大鼠海马组织中MDA浓度明显增多，而SOD活力显著降低，而经过8 周口服小麦肽干预后，CFS大鼠海马组织中SOD活力显著升高，MDA浓度大幅下降，提示小麦肽可通过降低氧化应激水平改善CFS大鼠的认知功能障碍。有研究表明，小麦肽分子质量对于其氧自由基清除能力有一定影响，分子质量越小，氧自由基清除能力越强。分子质量测定结果显示，本研究所用小麦肽主要组分分子质量小于1 000 Da，且其中分子质量小于270 Da的小肽占比高达66.28%，这可能是本研究中小麦肽具有显著抗氧化应激功能的主要原因。

此外，还发现CFS大鼠血清中色氨酸和海马组织中5-HT的水平明显升高，而神经细胞因子NGF和BDNF的含量显著减少，口服小麦肽可有效增加血清中NGF和BDNF的含量，降低CFS大鼠血清中色氨酸浓度和脑组织中5-HT含量。5-HT是一种被广泛研究的神经递质，是5-HT系统的重要组成之一。已有研究表明，以色氨酸为起始的5-HT系统功能紊乱是CFS发生的重要诱导因素，CFS患者血清中色氨酸浓度显著高于正常人群，其原因可能在于疲劳状态下脂肪供能比例增加，造成外周血中色氨酸浓度大幅上升，而循环中色氨酸透过血脑屏障进入大脑，促进5-HT能神经元分泌5-HT，这与本研究结果一致。NGF是重要的神经营养因子，对维持胆碱能神经元的完整性和功能起着重要作用，虽然NGF在CFS中的作用还未被阐明，但诸多实验结果已证实NGF在衰老和阿尔茨海默症等与年龄相关的疾病中能够促进神经元的存活和再生，有利于改善衰老或者退行性改变导致的认知功能障碍。同样，BDNF也是一种重要的神经营养因子，研究表明外周循环中BDNF水平的下降与CFS大鼠海马神经元凋亡和脑萎缩密切相关。本研究结果显示，口服小麦肽可以显著提高CFS大鼠外周循环中NGF和BDNF含量，这可能是小麦肽改善CFS大鼠认知功能的原因之一。

本研究还发现CFS大鼠血清中IL-10和IL-4质量浓度显著高于正常对照组，而TNF-β以及INF-γ质量浓度则显著低于正常对照组，经过8 周口服小麦肽干预后，CFS大鼠外周血中IL-10和IL-4水平显著上升，而TNF-β和INF-γ水平显著降低。IL-10和IL-4是典型的Th2型细胞因子，而TNF-β和INF-γ则为典型的Th1型细胞因子，结合上述研究结果认为，口服小麦肽促进CFS大鼠外周血中细胞因子由Th2型向Th1型转变。已有研究揭示CFS患者存在细胞因子失调的现象，而细胞因子失调进一步会诱导CFS患者的免疫失调，故靶向免疫调节的治疗也被认为是改善CFS症状的有效对策。根据相关报道，免疫失调与认知功能障碍发生密切相关，因此推测，CFS大鼠的认知功能障碍出现可能与免疫调节失衡有关，而口服小麦肽促进Th2型免疫反应向Th1型的转变，可能是改善CFS大鼠认知障碍的一个重要原因。

值得注意的是，氨基酸测序结果揭示小麦肽中支链氨基酸含量较丰富，约为14.04%。已有大量研究证实支链氨基酸具有显著抗氧化功能，因此认为较高含量的支链氨基酸可能是小麦肽降低氧自由基产生并改善CFS大鼠认知功能障碍的主要原因。同样，氨基酸测序结果也表明小麦肽中Glu含量高达34.55%，Glu是中枢神经系统中的关键兴奋性神经递质，被认为对维持大脑功能至关重要，在学习和记忆形成中发挥积极作用。先前研究证实补充Glu可以显著增加乙酰胆碱的释放从而提高实验大鼠的记忆力。与之相似，最近的一项研究显示，补充Glu可以通过改善大脑的神经递质和氧化还原系统提高实验动物的运动能力和认知功能。另外，该小麦肽中Pro含量达到10.79%，Pro被认为与认知功能改善密切相关，有研究表明富含脯氨酸的肽对阿尔茨海默症模型大鼠的认知功能障碍有明显改善作用，这种改善作用可能是通过刺激免疫和神经胶质系统来实现。

综上所述，口服小麦肽对CFS大鼠的认知障碍具有显著改善作用，其作用机理在于减少氧化应激，调节神经细胞因子释放以及平衡免疫失调。同时，较高含量的Glu、Pro以及支链氨基酸可能对该小麦肽改善CFS大鼠认知功能障碍具有重要作用。然而，在本实验结果中，认知功能的改善与小麦肽补充并无显著的剂量依赖性，优化的剂量还有待进一步探析；此外，本研究中缺乏市售CFS药物作为阳性对照，因此小麦肽缓解CFS的确切疗效还有待进一步验证。