本氏烟NbMBF1c的克隆、表达及在TMV侵染过程中的功能

温玉霞，张坚，王琴，王靖，裴悦宏，田绍锐，樊光进，马小舟，孙现超

西南大学植物保护学院植物病害生物学重庆市重点实验室，重庆 400715

0 引言

【研究意义】烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）是烟草花叶病毒属的典型代表种，可侵染十字花科、葫芦科、茄科等植物并且危害严重。目前对于TMV的控制多以预防为主，而挖掘抗TMV的植物基因对于遗传育种至关重要。多蛋白桥梁因子 1（multiprotein bridging factor 1，MBF1）是一个高度保守的转录辅激活蛋白，在细胞分化、脂类代谢、激素类物质调节和组氨酸类物质新陈代谢等过程中发挥重要作用。了解的抗病毒功能，对于抗病毒植株的遗传育种具有重要意义。【前人研究进展】MBF1是植物体内一种非常保守的转录因子，在植物的生物胁迫与非生物胁迫中发挥着重要的功能。MBF1蛋白包括两个结构域，C-末端的螺旋-折叠-螺旋结构域是TBP结合结构域，并且该结构域被认为在整个物种中都是保守的，N-末端是一个保守的锌带域，能够与转录因子相结合。在植物中，MBF1蛋白与植物的生长发育和响应胁迫反应相关。拟南芥中，过表达导致拟南芥的早期开花和种子数量增加；在大豆中过表达，提高了大豆的产量。对热胁迫下拟南芥的转录组进行分析发现，过表达植株中两种海藻糖-6-磷酸合成酶的相对表达量高于野生型植株，并且在热胁迫后过表达植株中响应胁迫反应的信号分子海藻糖水平更高，提高了植物对非生物胁迫的抗性。同时MBF1蛋白在植物响应生物胁迫也具有作用。拟南芥过表达植株中丁香假单胞菌（）的增殖低于野生型植物。此外，在拟南芥感染灰霉病菌（）后显著上调表达，与野生型植株相比，过表达后病斑面积更小，并且抗病相关基因和显著上调表达。【本研究切入点】能对包括细菌和真菌在内的多种病原物产生抗性，但其对于病毒侵染是否具有调控作用尚未报道。笔者实验室前期研究发现，本氏烟（）沉默转录组中的表达下调，但其对于 TMV侵染的响应尚不明确。【拟解决的关键问题】利用分子克隆得到全长，并利用生物信息学手段分析其蛋白特性。构建NbMBF1c荧光蛋白融合表达载体，分析其亚细胞定位；利用实时荧光定量PCR分析的组织表达与 TMV侵染胁迫表达，利用病毒介导的基因沉默技术与瞬时过表达分析对于TMV-GFP侵染的影响，实时荧光定量PCR分析影响TMV侵染的机制，为茄科作物抗病毒育种提供理论依据。

1 材料与方法

试验于 2020—2021年在西南大学植物保护学院植物免疫与植物病害生态防控实验室完成。

1.1 试验材料

1.1.1 菌株、质粒与植物材料 大肠杆菌（）DH5、农杆菌（）GV3101购自上海唯地生物技术有限公司；VIGS沉默载体和烟草花叶病毒荧光标记载体 TMV-GFP（pSDK661）由清华大学刘玉乐教授课题组馈赠；pART27-N-eGFP、pART27-N-7*Myc载体由西北农林科技大学单卫星教授馈赠。本氏烟在恒温育苗箱中播种（25℃，16 h光照/8 h黑暗，75%相对湿度），培养至4—6叶期左右备用。

1.1.2 试剂和引物 DNA纯化回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自北京擎科生物科技有限公司；TRIZOL、反转录试剂盒、高保真酶 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自宝日医生物工程（大连）有限公司；零背景平末端克隆载体Zero Background pTOPO-Blunt购自北京艾德莱生物科技有限公司；实时荧光定量试剂盒SYBR Prime qPCR Set购自重庆葆光生物技术有限公司。引物和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。引物详见表1。

表1 本研究所用到的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2 NbMBF1c的克隆与分析

使用TRIZOL法提取本氏烟总RNA，操作规程详见https://www.takarabiomed.com.cn/DownLoad/9108-9109.pdf。根据Sol Genomics Network茄科作物基因组数据库（https://solgenomics.net/）报道的核苷酸序列，设计特异引物扩增。采用PrimeSTARGXL DNA Polymerase DNA聚合酶扩增，操作详见https://www.takarabiomed.com.cn/DownLoad/R050A.pdf。将获得的序列连至Zero Background pTOPO-Blunt并转化至大肠杆菌感受态细胞 DH5，操作方法详见http://www.aidlab.cn/up_product/big/2017-4-1-10414853596.pdf。将阳性克隆菌液送至上海生工生物测序获得序列。

运用 ExPASy ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析NbMBF1c的蛋白理化性质，TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/）分析 NbMBF1c的跨膜区域；SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析NbMBF1c的保守结构域；NCBI Blastp比对出与NbMBF1c序列相似性较高的其他物种MBF1c蛋白，利用 MEGA X软件采用最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育进化树，根据模型推荐，BIC最小为3 741.994时模型参数设置为JTT+G,进化树的检验使用自展检验（Bootstrap method）法，检验次数1 000次。

1.3 TMV-GFP接种

TMV接种步骤参考文献[11]。取 0.1 g被TMV-GFP侵染的本氏烟叶片于研钵中，加入石英砂和pH 7.2—7.4的磷酸缓冲液研磨均匀。将获得的匀浆在5 000×离心机中离心3 min，取上清进行摩擦接种。每片叶片接种100 μL，每株植株接种第5、6叶位叶片。

1.4 NbMBF1c沉默载体的构建及浸润

沉默载体的构建基于烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）改造的沉默体系。首先根据的全长，利用在线工具VIGS Tool（https://vigs.solgenomics.net/）获得的最佳沉默片段，以此设计含有酶切位点H I和I的引物，将其连接在同样酶切位点的pTRV2载体上，构建pTRV2:NbMBF1c载体。以空载体pTRV2为对照，将 pTRV1和 pTRV2:转化至农杆菌GV3101中，28℃ 200 r/min过夜培养，利用重悬液（10 mmol·LMES，10 mmol·LMgCl，200 μmol·L乙酰丁香酮）重悬至OD=0.4，等比混合后静止2 h并注射4叶期本氏烟。

1.5 NbMBF1c酵母载体和NbMBF1c融合表达载体构建及浸润

根据获得的核苷酸序列全长和 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）TMV基因组的CP、MP和P50核苷酸序列设计携带酶切位点R I和I的引物，构建基于pGADT7和pGBKT7的酵母载体，将构建好的载体转化大肠杆菌扩繁获取质粒，以p53（p53）和SV40 large T-antigen（T）为阳性对照，将待验证的质粒转入酿酒酵母 AH109菌株，在SD-WL上生长5 d后转染SD-WLHA和SD-WHLA+X--Gal，验证二者的相互作用。设计携带酶切位点R I和I的引物，构建基于pART27的eGFP:NbMBF1c和Myc:NbMBF1c融合表达载体。将构建成功的载体转化至农杆菌感受态细胞 GV3101中，在携带壮观霉素与利福平的LB液体培养基中过夜培养，利用重悬液（10 mmol·LMES，10 mmol·LMgCl，200 μmol·L乙酰丁香酮）重悬至 OD=0.8，静止2 h后注射6叶期本氏烟。

1.6 实时荧光定量PCR

采用qTOWER2.0 real-time PCR（Analytikjena，Germany）和 SYBR Prime qPCR Set（重庆葆光生物，中国）分析靶基因的相对表达量。使用在线工具Primer3web（https://bioinfo.ut.ee/primer3/）设计基因特异性定量引物。选择本氏烟作为内参，使用2法定量计算基因转录水平的相对变化。

1.7 数据分析

所有试验和数据至少涉及3个重复，数据表示为均值±标准误，统计分析使用SPSS软件student’s检验（*0.01＜＜0.05，**0.001＜＜0.01，***＜0.001）和ANOVA单因素分析（LSD检验，＜0.05）。

2 结果

2.1 NbMBF1c的克隆与分析

全长441 bp，编码146个氨基酸。上传至NCBI，获得基因序列号ON009340。ProtParam预测显示NbMBF1c理论分子量为16.15398 kD，理论等电点10.07，分子式为CHNOS。TMHMM 2.0分析显示NbMBF1c蛋白不含跨膜结构。SMART分析显示 NbMBF1c蛋白有一个保守结构域 HTH（helixturn-helix）。

根据 NbMBF1c氨基酸序列，在 NCBI中通过Blastp比对出NbMBF1c的同源蛋白，下载17条不同物种 MBF1c的氨基酸序列利用ClustalX2进行多序列比对，结合GeneDoc绘制多序列比对图（图1-A），利用MEGA X软件采用ML法构建进化树。结果如图1-B所示，NbMBF1c与绒毛状烟草（）MBF1c（XP_009614458.1）的亲缘关系最近。

图1 NbMBF1c和其他植物MBF1c氨基酸序列比对及其系统发育分析Fig. 1 Amino acid sequence alignment and phylogenetic analysis of NbMBF1c and MBF1c from other plants

2.2 NbMBF1c的表达分析与亚细胞定位

利用实时荧光定量PCR检测在本氏烟各组织中的表达，发现其在根中的表达量显著高于其他组织，茎、叶和花中的表达量递减，表明的表达具有组织特异性（图2-A）。为了探究响应TMV侵染的方式，对6叶期的本氏烟接种TMV-GFP并以接种PBS作为对照。选取接毒后3、5 d的接种叶和7 d的系统叶，提取其RNA并反转录后检测的表达量。由图2-B可以看出，TMV侵染后3、5和7 d，表达均极显著高于 PBS对照，分别为对照的 47.59、499.54和 24.44倍，表明 TMV-GFP侵染后会诱导的表达，提示可能参与本氏烟抗TMV的响应。

为明确NbMBF1c的亚细胞定位，构建基于pART27的eGFP:NbMBF1c瞬时表达载体，并利用农杆菌介导的瞬时转染技术，在本氏烟叶片表皮细胞中共表达eGFP:NbMBF1c+mCherry:00和eGFP:NbMBF1c+细胞核定位标记mCherry:H2B，48 h后在激光共聚焦显微镜下观察到eGFP:NbMBF1c与mCherry:00和细胞核定位标记mCherry:H2B共定位，且利用ImageJ分析波尔逊共定位参数发现 eGFP:NbMBF1c与 mCherry:00和 mCherry:H2B都有很好的重叠性，表明 eGFP:NbMBF1c融合蛋白定位于细胞质和细胞核（图3-A）。但是对烟草接种TMV并不能引起eGFP:NbMBF1c的定位改变（图3-B）。

图2 NbMBF1c的表达分析Expression analysis of NbMBF1c

图3 NbMBF1c的亚细胞定位和TMV侵染下NbMBF1c的定位变化Fig. 3 Subcellular localization of NbMBF1c and localization change of NbMBF1c after TMV infection

2.3 沉默NbMBF1c对TMV-GFP侵染的影响

为明确对TMV-GFP侵染的影响，构建了 TRV介导的 VIGS载体 TRV:NbMBF1c。以TRV:00为对照，通过农杆菌浸润的方式对6叶期的本氏烟进行沉默。沉默14 d后，定量结果表明TRV:NbMBF1c植株中表达量显著低于对照植株，仅为对照植株的6.54%，说明被有效沉默（图4-C）。相较于对照植株，沉默植株呈现矮化和开花延迟（图4-A、4-B），提示在调控植物生长发育中可能具有重要作用。在沉默15 d时，对本氏烟摩擦接种TMV-GFP，并在紫外灯下观察病毒侵染情况。由图5-A可以看出，在2 dpi和 4 dpi时沉默植株接种叶上的绿色荧光数量明显多于对照组，并且5 dpi时沉默植株系统叶上的绿色荧光显著多于对照组，表明沉默促进了TMV-GFP的侵染。利用实时荧光定量PCR检测接种叶（2 dpi）和系统叶（5 dpi）中TMV的含量，结果如图5-B所示，沉默植株接种叶（2 dpi）和系统叶（5 dpi）中TMV-GFP表达量均显著高于对照植株，分别为对照的37.4和19.2倍，与紫外灯下观察结果一致。这些结果说明沉默促进了 TMV-GFP侵染，揭示可能为植物抗病毒正调控因子。

图4 沉默NbMBF1c表型及沉默效率检测Fig. 4 Phenotype and silencing efficiency detection in NbMBF1c silenced plant

图5 沉默NbMBF1c促进TMV-GFP侵染Fig. 5 Silencing of NbMBF1c promotes TMV-GFP infection

2.4 过表达NbMBF1c对TMV-GFP侵染的影响

TMV-GFP侵染后的表达上升，而沉默促进TMV-GFP侵染。为进一步明确在 TMV侵染时的作用，构建了重组质粒 pART27-7*Myc:NbMBF1c。以Myc:00作为对照，Myc:NbMBF1c瞬时表达48 h后，利用Western blot检测Myc:NbMBF1c的表达情况，并接种 TMV-GFP，在紫外灯下观察TMV-GFP的移动情况。结果显示，约在16 kD处有一条特异条带，与预期大小一致，而空载体无相应条带，说明 NbMBF1c蛋白在注射叶片中成功表达（图6-B）。接种TMV-GFP 4 d时，瞬时过表达植株叶片上出现零星的绿色荧光，而对照处理绿色荧光开始铺满整片叶子。接种 5 d时，瞬时过表达植株叶片上荧光数量略微扩大，而对照处理的绿色荧光已经扩散至系统叶（图6-A）。对系统叶TMV-GFP含量进行实时荧光定量 PCR检测，结果显示表达Myc:NbMBF1c的植株系统叶中 TMV-GFP含量显著低于对照，与观察结果一致（图6-C），表明瞬时过表达NbMBF1c抑制TMV-GFP侵染。综合以上结果，得出 NbMBF1c作为植物正调控因子抑制 TMV-GFP侵染。

图6 过表达NbMBF1c抑制TMV-GFP侵染Fig. 6 Overexpression of NbMBF1c inhibits TMV-GFP infection

2.5 NbMBF1c与TMV CP、MP和P50组分不互作，沉默NbMBF1c影响激素相关基因的表达

沉默显著加快了TMV-GFP侵染（图5），而瞬时过表达NbMBF1c则抑制了TMV-GFP侵染（图6），表明NbMBF1c在本氏烟抵抗病毒侵染的过程中起着积极作用。笔者推测NbMBF1c可能与病毒直接作用，采用酵母双杂交试验来验证此猜测，但结果发现NbMBF1c与TMV CP、MP和P50并未在酵母细胞内发生互作（图7）。NbMBF1c是一种高度保守的转录因子，其能与下游多个抗性基因启动子结合，因此笔者猜测可能会通过影响激素途径来参加植物抗病毒。为验证此猜测，对沉默植株中脱落酸（abscisic acid，ABA）合成关键酶基因、脱落酸受体ABA信号转导因子和蛋白激酶，茉莉酸（jasmonic acid，JA）合成关键酶基因茉莉酸信号受体的表达情况进行检测。结果表明，TRV:NbMBF1c中与ABA通路相关基因都显著上调表达，、、和分别是对照表达量的1.71、1.67、4.62和2.05倍（图8-A—8-D）。TRV:NbMBF1c中表达显著高于对照组，较对照增加了1.29倍，但的表达较对照显著下调，为对照的63%（图8-E、8-F）。这些结果揭示可能通过调控ABA和JA通路来影响TMV-GFP侵染。

图7 酵母双杂交分析NbMBF1c与TMV病毒组分的互作Fig. 7 The interaction of NbMBF1c and TMV virus components was analyzed by Y2H

图8 沉默NbMBF1c对ABA和JA相关基因表达的影响Fig. 8 Effect of NbMBF1c silencing on expression of ABA and JA related genes

3 讨论

3.1 MBF1c广泛参与植物的胁迫反应

在拟南芥、马铃薯、小麦、番茄等植物中，参与了植物的生物胁迫和非生物胁迫反应。根据这些报道，利用RT-PCR技术获得本氏烟全长序列441 bp，编码146个氨基酸，命名为。MBF1家族蛋白是在植物中广泛存在参与植物调节的一类共转录因子，小麦上和在根、叶片和籽粒中均有表达，主要在叶片中表达，而仅在根部中特异性表达；百合中的在叶中表达量最高，根中次之，鳞茎中最低；而本氏烟在根中表达量最高，茎、叶、花依次减少。构建的进化树表明，NbMBF1c与绒毛状烟草MBF1c（XP_009614458.1）的亲缘关系最近。这些来自其他物种共有HTH结构域的MBF1c蛋白能受到多种非生物胁迫诱导表达并且在提高植物抗逆能力上有积极作用。在多种非生物胁迫下，如热胁迫、过氧化氢处理、干旱和盐胁迫，的表达量会显著上调；AtMBF1c作为转录因子还能通过与TPS5相互作用并与启动子区域结合来调节拟南芥海藻糖合成并正调控对灰霉病菌的防御反应；在小麦上，受到小麦条锈菌（f. sp.）诱导高表达；过表达转基因番茄具有抗病原细菌DC3000和尖镰孢（）的能力。本研究表明，TMW侵染下极显著上调表达（图2-B），并且沉默促进TMV-GFP侵染（图5），而瞬时过表达 NbMBF1c抑制TMV-GFP侵染（图6），这些结果提示本氏烟的 NbMBF1c蛋白在植物病毒侵染过程中具有积极正调控作用。

3.2 TMV不能改变 NbMBF1c的亚细胞定位，并且NbMBF1c不通过与 TMV组分的互作来影响病毒侵染

在激光共聚焦显微镜下观察本氏烟叶片表达的eGFP:NbMBF1c融合蛋白定位在细胞质和细胞核中（图3），这与其他物种MBF1c亚细胞定位结果一致。洋葱表皮细胞定位试验显示小麦的 TaMBF1c主要定位在细胞核，部分定位在细胞质中；百合常温下LIMBF1c定位在细胞膜、细胞质和细胞核，热应激下LIMBF1c主要定位在细胞核中；而拟南芥MBF1c-GFP融合蛋白主要定位在细胞质中；值得注意的是，高温胁迫下三者的 MBF1c都发生了定位改变，大部分聚集在细胞核，MBF1c在响应热应激上起到了重要作用，但在本试验中，对烟草接种TMV并不能引起eGFP:NbMBF1c的定位改变（图3）。

拟南芥AtMBF1a和AtMBF1b均能与番茄花叶病毒（tomato mosaic virus，ToMV）的运动蛋白（movement protein，MP）互作，烟草的NtMBF1a能与 ToMV和十字花科植物烟草花叶病毒（crucifer tobamovirus，CTMV-W）的MP蛋白发生互作。然而，本研究酵母双杂交试验表明NbMBF1c与TMV病毒组分CP、MP和P50均不在酵母体内互作（图7），表明本氏烟NbMBF1c可能不通过与病毒组分直接互作参与抗病毒防御。

3.3 NbMBF1c通过调控植物激素的产生和信号传导来抑制TMV侵染

植物激素是一类能调节植物生长发育的微量有机物质，在非生物胁迫和生物胁迫中均发挥着重要作用。在沉默后，ABA合成关键酶基因脱落酸受体、ABA信号转导因子和蛋白激酶均显著上调表达，这一定程度上反映了ABA激素的升高。外施ABA可以促进水稻黑条矮缩病毒（rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）侵染，沉默会抑制病毒的侵染，这说明ABA负向调节水稻对RBSDV的抗性。外施茉莉酸甲酯可以促进TMV的侵染和移动，的沉默降低了TMV的积累水平，在本氏烟上沉默能够促进病毒的侵染。这与本研究结果是一致的，即沉默后，茉莉酸合成途径上调表达，茉莉酸信号通路上的受体下调表达（图8-E、8-F），TMV积累增加。在植物激素抵抗病毒侵染中，茉莉酸和水杨酸（salicylic acid，SA）是一对拮抗激素。有研究表明，JA可以调节 SA的产生，在本氏烟受到TMV-GFP侵染时，立即激活JA信号以建立早期的系统性抗性，随后JA信号调控SA产生，激活SA信号，建立广泛的系统抗性；拟南芥上，丁香假单胞菌诱导产生MeSA需要JA的生物合成，并依赖和介导的JA下游信号传导。后续的试验发现，沉默后，水杨酸通路的表达量没有变化（图8-G），笔者推测是由于表达量下调，JA信号传递给SA效率降低，SA不能在植株受到病毒侵染时起到可靠的防御作用。这些结果表明本氏烟通过影响ABA和JA信号途径进而调控寄主抗TMV。

4 结论

的表达受 TMV侵染诱导。NbMBF1c主要定位于细胞质和细胞核中，能够作为 TMV的抗性基因抑制病毒在本氏烟上的侵染。NbMBF1c不通过直接与 TMV组分互作来抑制病毒侵染，可以通过调控植物激素的产生和信号传导来抑制病毒侵染。