氨茶碱对脂多糖诱导的慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的作用

刘 芳，杜文秀，张 欣，杜俊凤，张 颖，迟玉敏

沧州市中心医院呼吸科，沧州 061000

慢性阻塞性肺疾病(COPD)具有患病率高、病程迁延、反复发作急性加重等特点[1-2]。当前尚未具体明确其发病机制，考虑与炎症反应、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化-抗氧化失衡等因素有关[3-4]。其中肺局部存在的氧化-抗氧化失衡是导致COPD患者肺组织出现一系列病理变化的始动因素。氨茶碱是一种常用支气管舒张药物，具有抑制炎症反应、减轻氧化损伤和免疫调节等作用，可激活组蛋白去乙酰基酶活性，控制气道平滑肌细胞增生、气道重塑，减轻肺损伤[5]。本研究通过开展动物实验，着重分析氨茶碱对脂多糖诱导COPD大鼠肺功能、氧化-抗氧化失衡的影响及机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

小动物肺功能仪(北京贝兰博科技有限公司)，Mx3005P实时荧光定量分析仪(美国安捷伦科技公司)。

1.2 试药

氨茶碱(浙江瑞新药业股份有限公司)；红旗渠香烟(河南安阳卷烟厂)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)试剂盒(美国Cayman公司)；白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(美国Trevigen公司)；兔抗大鼠Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)一抗及山羊抗兔IgG二抗(美国Bio-Rad公司)。

1.3 实验动物

选取48只健康SD大鼠，清洁级，均为雄性。大鼠7周龄，体质量260～280 g，购自浙江大学医学院附属第一医院，许可证号：SYXK(浙)2019-0012。试验前在温度(22±2) ℃、相对湿度55%、12 h光照环境中适应性喂养7 d。本研究经动物伦理委员会批准。

2 方法

2.1 模型制备及分组

48只大鼠中随机取10只为A组，另38只建立COPD大鼠模型[6]：自制烟熏箱(60 cm×60 cm×70 cm)，大鼠放置在箱内熏烟，先点燃8支香烟，燃尽后再点燃8支，时间约30 min。周一至周五每日2次，周六、周日每日1次，共3个月。烟熏后首月末、次月末，腹腔注射麻醉大鼠，纵行切开颈部皮肤，气管分离。以含200 μg脂多糖溶液0.2 mL缓慢注入气道，当日不被动吸烟。建模成功标准：建模后大鼠出现躁动不安、咳嗽气急、行动迟缓、精神萎靡、毛发枯黄、体质量减轻等症状。38只大鼠建模成功36只，采用随机体质量排序法分为B组、C组和D组，各12只。A组在相同箱内作伪暴露，气道注入生理盐水中，10只大鼠均纳入研究。

2.2 动物干预

建模成功后即刻给药。将氨茶碱片1 200 mg溶解于50 mL生理盐水中，配制成质量浓度10 mg·mL-1溶液。根据人与动物之间给药剂量换算。氨茶碱成人临床有效剂量为13 mg·kg-1，换算成大鼠剂量为80 mg·kg-1。C组、D组分别给予1.0、2.0倍临床有效剂量，即80、160 mg·kg-1氨茶碱溶液灌胃。A组、B组以等体积生理盐水灌胃。每日1次，治疗3个月。

2.3 肺功能检测及动物取材、处理

治疗后24 h，大鼠腹腔注射麻醉，仰卧位固定在鼠板上。纵行切开颈部皮肤，暴露气管。将一倒“T”型切口作于环状软骨下两气管环处，气管插管。胸腔插管连接小动物肺功能仪压力传感器经肋间隙插入胸膜腔，检测第0.3 s用力呼气容积(FEV0.3)、用力肺活量(FVC)、潮气量、跨肺压。计算第0.3 s用力呼气容积与用力肺活量的百分比[(FEV0.3/FVC)%]、动态肺顺应性(潮气量/跨肺压)。检测后麻醉未清醒前断头处死，开腹，取肺组织，分为5 份，其中1份置于-80 ℃冰箱中保存，3份置于液氮中保存，1份置于40 g·L-1多聚甲醛中固定。

2.4 SOD、MDA、GSH水平

取冰箱保存肺组织，经生理盐水制备组织匀浆，以12 000 r·min-1离心5 min，半径8 cm，取上清液。黄嘌呤氧化酶法检测SOD，硫代巴比妥酸法检测MDA，微量还原型谷胱甘肽试剂盒检测GSH，按照试剂盒使用说明书操作，根据标本吸光度值获得其对应水平值。

2.5 IL-8、TNF-α水平

采用酶联免疫吸附法检测。取1份液氮保存肺组织，冰浴，制备匀浆，离心，取上清液。按照IL-8、TNF-α试剂盒说明书操作，根据标本吸光度值获得质量浓度值。

2.6 Keap1、Nrf2、HO-1 mRNA相对表达量

采用RT-PCR法检测。取1份液氮保存肺组织，提取总RNA，检测质量浓度。进一步逆转录成cDNA，进行RT-PCR反应。以Primer Premier 5设计目的基因、内参基因引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列：Keap1：F：5′-CTTTGCCGACTTCCACCAA-3′，R：5′-CCGCGATTTATGAGGTCAGT-3′。Nrf2：F：5′-CCATGCCTTCTTCCACGAA-3′，R：5′-AGGGCCCATGGATTTCAGTT-3′。HO-1：F：5′-TGTGTGATGCCACCAGATTT-3′，R：5′-GCTTTTCACGATGACCGAGT-3′。β-actin：F：5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3′，R：5′-GATCCTTACCACTCCTTGCGAG-3′。反应体系： Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物、下游引物各1 μL，cDNA 1.5 μL。反应条件：95 ℃预变性，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；72 ℃，30 s；72 ℃，10 min，40个循环。琼脂糖凝胶电泳，计算Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA相对表达强度(2-△△CT)。

2.7 肺组织病理形态学

采用HE染色法检测。取40 g·L-1多聚甲醛固定肺组织，磷酸盐缓冲液浸泡10～12 h。脱水，石蜡包埋，切片厚4 μm。二甲苯透明，梯度酒精脱蜡。苏木精、伊红染色。梯度酒精脱蜡，二甲苯透明，中性树胶封片。

2.8 Keap1、Nrf2、HO-1 蛋白相对表达量

采用蛋白质印迹法检测。取1份液氮保存肺组织，磷酸盐缓冲液冲洗2次，制备匀浆，离心。二喹啉甲酸法行蛋白定量，加2×上样缓冲液，沸水浴变性。100 g·L-1十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白分离，转膜，加50 g·L-1脱脂奶粉封闭1 h。加兔抗大鼠Keap1、Nrf2、HO-1和β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃摇床，孵育过夜，洗膜。加二抗(1∶2 500)，室温孵育2 h，洗膜。加ECL试剂，显影曝光成像，观察相应蛋白条带灰度值。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 肺功能指标

FEV0.3、FEV0.3/FVC和肺顺应性组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与A组比较，B组、C组和D组FEV0.3、FEV0.3/FVC、肺顺应性降低，B组

表1 各组肺功能指标对比

3.2 SOD、MDA和GSH水平

SOD、MDA和GSH水平组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与A组比较，B组、C组和D组SOD水平降低，MDA、GSH水平升高，且SOD，B组

表2 各组SOD、MDA和GSH水平 (mg蛋白计,

3.3 IL-8和TNF-α水平

IL-8、TNF-α水平组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与A组比较，B组、C组和D组IL-8、TNF-α水平升高，D组

表3 各组IL-8和TNF-α水平对比

3.4 肺组织病理形态学

HE染色显示，A组肺泡腔结构完整，肺间质无炎性细胞浸润，细支气管无明显分泌物。B组肺泡壁厚度增加，存在细支气管渗出，肺间质及细支气管周围存在大量炎性细胞浸润。与B组比较，C组、D组肺泡壁增厚、细支气管渗出、炎性细胞浸润等异常病理变化减轻，其中D组改善更显著。见图1。

图1 各组肺组织病理形态学变化 (HE×200)

Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与A组比较，B组、C组和D组Keap1 mRNA相对表达量升高，Nrf2、HO-1 mRNA相对表达量降低，且Keap1 mRNA相对表达量，D组

表4 各组Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA相对表达量对比

3.6 Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相对表达量

Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与A组比较，B组、C组和D组Keap1蛋白相对表达量升高，Nrf2、HO-1蛋白相对表达量降低，且Keap1蛋白相对表达量，D组

图2 各组Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达比较

表5 各组Keap1、Nrf2、HO-1蛋白相对表达量对比

4 讨论

COPD是一种常见肺部非特异性炎症性疾病，主要特点为不完全可逆、进行性加重的气流受限[7-8]。氧化-抗氧化失衡在COPD发生发展中发挥重要作用，可引发炎症反应，导致抗蛋白酶失活，造成肺损伤[9]。因此，纠正患者体内氧化-抗氧化失衡，已成为治疗COPD、减轻肺损伤的新途径。现代医学既往研究多倾向于缓解症状、预防及治疗并发症等方面，就氧化-抗氧化失衡作用分析较少[10]。

研究发现[11]，氨茶碱不仅能促进支气管平滑肌舒张，还可抑制炎症介质释放，缓解气道高反应性，兴奋呼吸中枢，减轻肺功能损伤。还有报道显示[12]，氨茶碱可降低低氧诱导的细胞内活性氧水平增高，缓解COPD急性加重期患者临床症状，但其对氧化-抗氧化失衡影响及机制尚不明确。本研究表明，氨茶碱给药后大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、肺顺应性和SOD升高，MDA、GSH、IL-8和TNF-α水平降低，HE染色显示肺组织病理形态学异常改变减轻，效果呈剂量依赖性，这提示氨茶碱可减轻COPD大鼠炎性反应，缓解肺功能损伤，改善氧化-抗氧化失衡。

Keap1-Nrf2/HO-1信号通路为近年来发现的可抵抗氧化刺激的防御性传导通路，在维持体内抗氧化物与过氧化物平衡中具有重要意义[13-14]。其中Nrf2为机体调节抗氧化系统重要转录因子，在COPD发病机制中发挥对抗氧化应激保护作用[15-16]。Keap1为Nrf2调节关键因子，多与Nrf2结合分布在细胞浆内，易受相关自由基、化学物质刺激导致Keap1、Nrf2解离，Nrf2转位进入细胞核，诱导HO-1等下游抗氧化蛋白表达，发挥抗氧化作用[17]。LI J等[18]发现，人参二醇可减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤，机制可能与调控Keap1-Nrf2/HO-1信号通路有关。研究发现[19]，机体出现氧化应激后，Keap1-Nrf2通路可被激活，调控下游抗氧化蛋白表达，减弱氧化应激程度，抑制炎性因子释放。还有学者提出[20]，Keap1-Nrf2/HO-1信号通路激活可减轻戊四氮诱导的小鼠氧化应激损伤，维持氧化-抗氧化平衡。这些研究提示，Keap1-Nrf2/HO-1信号通路可能在COPD患者肺功能及氧化-抗氧化失衡调节中发挥作用。本研究结果显示，氨茶碱给药后大鼠Keap1 mRNA及蛋白相对表达量降低，Nrf2、HO-1mRNA及蛋白相对表达量升高，效果呈剂量依赖性，这提示氨茶碱可激活Keap1-Nrf2/HO-1信号通路，推测这是其发挥改善COPD大鼠肺功能及氧化-抗氧化失衡的重要作用机制之一。

综上所述，氨茶碱可减轻脂多糖诱导的COPD大鼠肺功能损伤，改善氧化-抗氧化失衡，其作用机制可能与激活Keap1-Nrf2/HO-1信号通路有关。但本研究并未就其他通路进行分析，而氨茶碱发挥作用是经过多种途径实现的，故今后仍需进一步深入研究。