动物源性面制品中氨基脲来源分析

郭思言，王俊苏，郗存显，唐柏彬，郑小玲，莫 敏，郑 文，关天横，李贤良

（重庆海关技术中心，重庆 400020）

氨基脲（Semicarbazlde，SEM）又称氨基甲酰肼，是一种联胺类小分子化合物，通常被认为是抗生素呋喃西林药物的特征性代谢物[1]。SEM致癌性强，国外对呋喃西林药物实行禁用后，禽肉中SEM超标的样品数量却屡增不减，同时欧盟在植物源性的罐装食品中也发现SEM，SEM的来源引起了广泛关注[2-3]。SEM在动物源性面制品中的来源之一是呋喃西林药物代谢物，作为稳定的代谢产物，化学性质较原药稳定，因此往往被作为呋喃西林药物的检出依据；另一来源是面粉添加剂偶氮甲酰胺（Azodicarbonamide，ADC）的降解代谢物，ADC在高温高湿环境下，会降解生成SEM，对于甲壳类水产面制品类如炸虾，SEM还可能是内源性物质[4-6]。于慧娟等[7]研究发现SEM作为内源性物质普遍存在于虾、蟹等甲壳类水产品中，经过文献查阅大部分国内对虾内源性SEM含量约在1 μg·kg-1[8]。由于ADC在降解过程中还有另一主要降解产物联二脲（Biurea，BIU），且BIU不会由氨基脲转化而来，因此SEM是否由ADC降解产生，可通过测定ADC的降解产物BIU进行辨别。

本文通过制作添加ADC的炸鸡和炸虾，建立了液相色谱质谱联用法测定动物源性面制品中BIU的方法[9-10]。同时参考标准方法GB/T 21311—2007中的前处理方式，在步骤中增加蛋白沉淀环节，建立了测定SEM的方法。探究了面粉及动物源性面制品中ADC、BIU和SEM三者的含量关系，为食品中SEM的污染来源提供了判断依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

面粉、鸡腿肉、虾肉，均购自当地超市；BIU（纯度≥99.5%，美国Chem Service）；ADC（纯度≥99%，美国Sigma公司）；13C2,15N2-BIU（纯度≥99.5%，加拿大Toronto Research Chemicals公司）；SEM（纯度≥99%）、13C,15N2-SEM（纯度≥99%），德国Dr. Ehrenstorfer公司；水为超纯水，Millipore超纯水仪制备；邻硝基苯甲醛（纯度≥98%，美国Sigma公司）；乙酸锌（上海强顺化工试剂有限公司）；盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾和亚铁氰化钾（分析纯，重庆川东化学试剂厂）；高锰酸钾（重庆川东化工有限公司）；乙腈、正己烷、二甲亚砜和乙酸乙酯（色谱纯，美国TEDIA公司）；甲酸（纯度＞99%，美国ROE公司）；冰醋酸（色谱纯，美国FLUKA公司）；对甲苯亚磺酸钠（纯度＞95%，美国Sigma公司）；乙酸铵（纯度＞99%，美国Sigma公司）。

1.1.2 仪器

API 4000高效液相色谱串联质谱仪（AB sciex，美国）；强力振荡器（北京安捷来科学仪器设备有限公司）；Sartorius BS224S型天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；XH-B型旋涡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）；Milli-Q超纯水系统（Millipore，美国）；3-30K型离心机（Sigma，德国）。

1.2 实验方法

1.2.1 面糊的制备

准确称取30 g面粉，分别添加浓度水平为0 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1和45 mg·kg-1的ADC标液，加入40 mL水搅拌混匀调成面糊。

1.2.2 炸鸡腿的制备

新鲜鸡腿洗净，用刀在每个鸡腿上都划几刀，在鸡腿上均匀挂一层1.2.1中制作的面糊；炸锅里的油温加热约达150 ℃（约五六成热），将鸡腿轻轻放入油锅中，并用筷子不停地翻面，直到将鸡腿炸成金黄色为止，捞出后沥油。取鸡腿的面粉层、鸡肉内层、鸡肉外层分别制样。

1.2.3 炸虾球的制备

取鲜虾去头、尾和虾壳，于粉碎机内粉碎，称取10 g虾肉揉搓成球状，为了使虾肉成型，可以沾上薄薄的一层淀粉，将虾球放入1.2.1制作的面糊中，裹上一层面糊；炸锅里的油温加热约达150 ℃，将裹上面粉浆的虾球轻轻放入油锅中，并用筷子不停翻面，直到将虾球炸至焦黄色熟透为止，捞出后沥油。取虾球的面粉外壳、虾球内层、虾球外层分别制样。

1.2.4 标准曲线的配制

准确称取适量BIU和13C2,15N2-BIU标准品，用水溶解并配制成浓度为20 mg·L-1的BIU标准储备液和浓度为10 mg·L-1的13C2,15N2-BIU内标工作液。室温储存，有效期1个月。根据需要取适量的标准储 备液 用 水 稀 释 成1 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、100 μg·L-1、1 000 μg·L-1和20 000 μg·L-1的系列标准工作液，临用现配。

准确称取适量SEM和13C,15N2-SEM标准品，用甲醇溶解并配制成浓度为100 mg·L-1的SEM标准储备液和13C,15N2-SEM内标工作液，-18 ℃保存，有效期3个月。根据需要取适量的标准储备液用甲醇稀释成0.5 μg·L-1、1.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1和100.0 μg·L-1的系列标准工作溶液，临用现配。

1.2.5 BIU的测定

（1）样品前处理。准确称取2.0 g（精确至0.001 g）样品于50 mL离心管中，分别加入浓度为10 mg·L-113C2,15N2-BIU内标工作液0.2 mL和10 mL水，涡旋混匀，采用5 mL正己烷脱脂后，于振荡器上振荡 提 取15 min，8 000 r·min-1离 心5 min，吸 取 上层清液于25 mL比色管中，重复提取1次，合并提取液，分别加入2 mL 1.00 mol·L-1乙酸锌溶液与0.25 mol·L-1亚铁氰化钾溶液，用水稀释至刻度，提取液转移至50 mL离心管，加入5 mL正己烷，8 000 r·min-1离心3 min，准确吸取5 mL下层待测液于另一离心管中，加入200 μL 0.14 mol·L-1高锰酸钾溶液，振荡反应30 min，加入50 μL二甲基亚砜，振荡3 min后，加入2.5 mmol·L-1对甲苯亚磺酸钠溶液5 mL，振荡衍生反应10 min，离心，过0.22 μm有机滤膜后供液相色谱质谱分析。

（2）色谱测定条件。色谱柱：Shimpak XRODSⅡ（150 mm×2.0 mm，2.2 μm）；流动相A为乙腈，流动相B为2 mmol·L-1乙酸铵溶液（含0.2%甲酸）；流速：0.3 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱的梯度洗脱程序

（3）质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）；离子化模式：正离子模式；扫描方式：多反应监测（MRM）模式；离子源温度（TEM）：650 ℃；毛细管电压（IS）：5 500 V；气帘气压力（CUR）：35 psi；雾化气压力（GS1）：80 psi；辅助气压力（GS2）：50 psi；监测离子对、驻留时间、去簇电压和碰撞电压等参数见表2。

表2 监测离子对、驻留时间、去簇电压和碰撞电压等参数表

1.2.6 SEM的测定

（1）样品前处理。称取1 g样品（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，分别加入浓度为20 μg·L-1的13C,15N2-SEM内标溶液100 μL，用10 mL 0.1 mol·L-1盐酸溶液提取，加入200 μL 0.1 mol·L-1邻硝基苯甲醛溶液（二甲亚砜配制）衍生，涡旋混匀，置于37 ℃恒温箱中振荡反应16 h。取出样品，待冷却至室温后加入1.0 mol·L-1磷酸二氢钾溶液5 mL，用1.0 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～7.5，依次加入2 mL 106 g·L-1亚铁氰化钾溶液和220 g·L-1乙酸锌溶液沉淀剂，加入15 mL乙酸乙酯提取，离心，收集乙酸乙酯层于旋蒸瓶，重复提取1次，于40 ℃下水浴旋转蒸发至近干，加入1 mL乙腈-水（2∶8，V/V）溶解残渣，用2 mL乙腈饱和的正己烷脱脂，样液过0.22 μm滤膜后供液相色谱质谱分析。

（2）色谱测定条件。高效液相色谱-质谱/质谱仪：四极杆串联质谱；离子源类型：ESI；色谱 柱：Shimadzu VP-ODS C18（150 mm×2.0 mm，5 μm）；流动相A为乙腈，流动相B为水；流速：0.3 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；梯度洗脱程序见表3。

表3 液相色谱的梯度洗脱程序

（3）质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）；离子化模式：正离子模式；扫描方式：多反应监测（MRM）模式；毛细管电压：5 500 V；离子源温度（TEM）：550 ℃；气帘气（CUR）：45 psi；雾化气（GS1）：20 psi；辅助气（GS2）：60 psi；碰撞气（CAD）：10 psi；监测离子对、驻留时间、去簇电压和碰撞气能量等参数见表4。

表4 监测离子对、驻留时间、去簇电压和碰撞气能量等参数表

2 结果与分析

2.1 线性范围

以BIU的浓度与内标13C2,15N2-BIU的浓度比为横坐标，衍生产物对甲苯磺酰氨基脲的峰面积与13C15N-对甲苯磺酰氨基脲峰面积比值为纵坐标，进行线性回归分析。结果表明，BIU在1～20 000 μg·L-1具有良好的线性关系，线性方程为y=1.219 6x+0.030 9，相关系数R2为0.999 9。

以SEM浓度与内标13C,15N2-SEM的浓度比为横坐标，氨基脲衍生化产物峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标进行线性回归，SEM在0.50～100.00 μg·L-1线性关系良好，回归方程为y=0.029 3+0.145 5x，R2为0.999 4。

2.2 回收率和精密度

选取经测定本底不含BIU和SEM的面粉外壳、炸鸡肉和炸虾肉3种样品，分别添加BIU浓度为1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-13个水平的标液和SEM浓度为0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-13个水平的标液进行添加回收试验，每个添加水平进行6个平行测定。结果表明，BIU的平均回收率为81.6%～109.3%，RSD为2.78%～11.67%。SEM的平均回收率为88.8%～99.4%，精密度为4.8%～11.5%，满足分析需求。具体结果见表5、表6。

表5 不同面粉制品中BIU的平均回收率和精密度（n=6）

表6 不同面粉制品中SEM的平均回收率和精密度（n=6）

2.3 ADC在炸鸡肉和炸虾肉中形成BIU和SEM的影响因素

测定经处理的炸鸡肉与炸虾肉中BIU与SEM的含量，结果如表7所示。当面粉中不含ADC时，制作的炸虾球与炸鸡肉中面粉和肉中均未检出BIU，面粉部分和鸡肉中均未检出SEM，但在虾 肉 中 检 出 少量 的SEM（含 量 为1.5 μg·kg-1）。当面粉中ADC的添加量为10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、45 mg·kg-1时，炸鸡腿与炸虾球的面粉部分、肉表层与内层均检出了BIU与SEM，且含量远高于空白组中的含量，随着ADC添加量的增大其检出量也呈增加的趋势。表明添加ADC的面粉经处理后会产生BIU和SEM扩散至肉中。同时经线性拟合发现，面粉部分、鸡肉内外层、虾肉内外层的BIU含量与ADC的含量呈较好的线性关系，相关系数r为0.972 1～0.998 6。

表7 含ADC面粉处理的炸鸡腿和炸虾肉中BIU和SEM的含量

而在同一ADC添加浓度下，鸡肉与虾肉中BIU与SEM的含量由外到内逐渐递减。在炸虾肉面粉层中BIU与SEM的含量分别是外层虾肉的3.5～4.2倍与3.5～9.5倍，虾肉外层BIU与SEM含量分别是内层的1.5～2.2倍与1.1～3.5倍，炸鸡肉中面粉层中BIU与SEM的含量分别是外层鸡肉的5.6～7.9与4.2～11.1倍，外层鸡肉BIU与SEM含量分别是内层鸡肉的3.1～4.8倍与3.7～13.4倍；说明添加ADC的面粉处理肉制品后，降解生成的BIU与SEM会向鸡肉与虾肉里层扩散，到达越里层的肉中BIU与SEM越少。

MULDER等[11]研究了新鲜的海鲜与禽类、面粉处理后的海鲜与禽类中的BIU与SEM的含量，发现ADC面粉处理后的肉类中SEM的含量远高于新鲜的肉类，这与本研究的结论一致。如果面粉处理的肉制品中测定出不含有BIU，那么SEM可能来源于呋喃西林的代谢残留；如果检测出BIU，那么SEM还可能来源于ADC的降解。因此，可将BIU作为区分动物源性食品中SEM来源的一种指示性化合物。同时，MULDER等[11]研究发现，ADC处理后的肉制品中如果含有1 μg·kg-1的SEM，则至少含有50 μg·kg-1的BIU；而本研究发现ADC处理后的肉制品中如果含有1 μg·kg-1SEM，则至少含有89 μg·kg-1的BIU，造成这一差异的原因可能是肉制品的加工制作工艺不同。

综上所述，炸鸡肉与炸虾肉中若其面粉中添加ADC，相应样品中会检出SEM，使呋喃西林药物的检测出现假阳性结果，而测定ADC的特征性降解产物BIU的含量可以鉴别食品中SEM的来源。同时，可通过降低面粉中ADC的添加量以达到减少SEM的目的，从而确保面制品食品安全。

3 结论

本文通过制作添加不同水平ADC面粉的炸虾肉和炸鸡肉，利用经验证的液相色谱串联质谱法分别测定其面粉层、肉表层、肉里层的BIU和SEM含量，并探究炸虾肉和炸鸡肉的不同部位中ADC的添加量与BIU和SEM生成量的关系，发现含有ADC的面粉处理后的肉类中SEM的含量一方面来源于呋喃西林药物代谢，另一方面来源于面粉中偶氮甲酰胺的降解产物，部分虾肉中还有可能是内源性物质，因为ADC降解产物中包含BIU，而BIU不会由SEM转化而来，所以可将BIU作为动物源性面制品中SEM来源于ADC的一种指示性化合物。