响应面结合遗传算法优化鹰嘴豆中抗炎活性成分的提取

牛华周, 康贺磊, 侯万超, 刘春明, 李赛男, 张语迟, 刘 震

(长春师范大学中心实验室1，长春 130032) (长春师范大学数学学院2，长春 130032)

鹰嘴豆(cicerarietinumL.)又名鸡豆和桃豆等，是豆科鹰嘴豆属植物鹰嘴豆的种子，在我国多个省份均有种植[1]，具有补中益气、温肾壮阳、主消渴之功效[2]。近年来，国内外对鹰嘴豆的生物活性研究多有报道，鹰嘴豆中所含的异黄酮类成分具有抗氧化和抑制Caco-2细胞生长等作用[3]，但是对于鹰嘴豆中抗炎活性的研究报道很少。而5-脂氧合酶对于炎症的发生存在着密不可分的关系[4]，因此利用5-脂氧合酶对鹰嘴豆中抗炎活性成分进行初步研究，为从鹰嘴豆中分离抗炎活性成分提供一定的参考。

鹰嘴豆异黄酮提取工艺参数的优化是非线性的拟合过程，因此利用遗传算法较为合适。遗传算法是一种模拟自然进化过程的全局寻优算法[5]，在优化天然产物有效成分的提取条件中有着广泛应用[6]。本实验利用响应面对鹰嘴豆异黄酮提取过程中的超声时间、乙醇浓度和料液比3个因素进行模拟推算，将响应面优化所得的拟合函数作为遗传算法的适应性函数，在程序中进行个体评价、选择运算、交叉运算以及变异运算。运行遗传算法优化利用Matlab 2018b程序和程序附带的GAOT工具箱完成[7]。

实验以鹰嘴豆为研究对象，首先从单因素水平考察了提取条件对提取率的影响；其次，应用响应面结合遗传算法优化鹰嘴豆异黄酮的提取方法；利用超滤-质谱技术对鹰嘴豆粗提中的化学成分进行抗炎活性成分筛选。应用液-质联用技术对鹰嘴豆中抗炎活性成分进行初步鉴定。

1 材料与仪器

1.1 材料与仪器

鹰嘴豆；5-脂氧合酶；乙腈(色谱级)；超滤离心管(100 ku)。

Waters 2695高效液相色谱仪，LCQ-Fleet超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪，DK-98-Ⅱ恒温水浴锅，KQ-400DE型超声波清洗器。

1.2 方法

1.2.1 超声辅助提取工艺的优化

1.2.1.1 芦丁标准品标准曲线的绘制

取5.12 mg芦丁标准品用65%乙醇溶液溶解、定容于25.0 mL容量瓶中备用。分别取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL芦丁标准品溶液，按照文献[8]方法分别加入显色剂，显色10 min，采用紫外-可见分光光度计在510 nm测定不同浓度芦丁标准溶液的吸光度，制作鹰嘴豆异黄酮浓度吸光度标准曲线。

1.2.1.2 鹰嘴豆的提取

鹰嘴豆粉碎后过100目筛，按料液比加入乙醇溶液，超声提取，过滤后蒸干，用65%乙醇溶解，显色，测定鹰嘴豆异黄酮含量。

1.2.1.3 单因素实验

准确称取粉碎后的鹰嘴豆5.0 g，采用超声法提取鹰嘴豆异黄酮，分别考察了超声时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)、乙醇体积分数(35.0%、45.0%、55.0%、65.0%、75.0%、85.0%、95.0%)和料液比(1∶10.0、1∶15.0、1∶20.0、1∶25.0、1∶30.0、1∶35.0、1∶40.0 g/mL)对鹰嘴豆异黄酮提取率的影响。

1.2.1.4 响应面实验

依据单因素实验结果，选取超声时间(X1)、乙醇浓度(X2)和料液比(X3)为实验因素，以异黄酮得率(Y)为响应值，利用Design-Expert中的Box-Behnken组合，进行3因素3水平的响应面实验，实验因素与水平设计如表1所示。

表1 实验设计因素与水平

采用响应面分析法得到的二次回归模型如式(1)所示。

(1)

式中：Xi和Xj为自变量，b0、bi、bii和bij分别为截距、线性回归、二次项的回归、各交互项的回归的系数[9]。

1.2.1.5 遗传算法设计优化

在MATLAB程序中，利用神经网络工具箱对数据进行神经网络建模。实验创建的提取因素优化模型为3层ANN模型(输入层、隐含层和输出层)，输入层作为自变量；输出层给出因变量[10]。选择超声时间、乙醇浓度和料液比为自变量，鹰嘴豆异黄酮提取率为因变量，选择输入层3个神经元，输出层1个神经元的网络模型。经过多次训练实验，得到了最佳的神经网络模型。采用优化得到的拟合函数，利用遗传算法对输入变量(超声时间、乙醇浓度和料液比)进行优化，以使鹰嘴豆异黄酮提取率最大为目标。设置遗传算法的搜索范围大小为-1～1，优化得出全局优化解[11]。

图1 超声提取鹰嘴豆中异黄酮的ANN模型

1.2.2 超滤-质谱法筛选鹰嘴豆提取物中5-脂氧合酶抑制剂

200.0 μL的反应体系分别由100.0 μL Tris-HCl缓冲溶液、20.0 μL 300 mg/mL样品溶液与80.0 μL不同浓度的5-脂氧合酶溶液(0、0.5、1.0和10 U/mL，pH 7.2～7.4)组成，将反应体系涡旋振荡，混匀后37 ℃水浴孵育30 min，利用超滤膜(100 ku)分离与酶结合的复合物和未结合的小分子，分离时采用离心机在13 000 r/min的条件下离心10 min。加入100.0 μL Tris-HCl缓冲溶液冲洗超滤膜，冲洗未结合的小分子化合物，离心10 min，重复该操作3次。再加入100.0 μL 50%甲醇水(50∶50)溶液，释放与5-脂氧合酶结合的活性小分子，离心10 min，重复步骤3次。将甲醇洗脱液合并，分析测定各活性成分的含量。空白对照组由缓冲溶液代替酶溶液，其他条件不变，重复实验3次。活性成分与酶的结合能力以增强因子表示，计算公式为：

(2)

式中：A1为与5-脂氧合酶结合的活性小分子化合物的量；A2为未与5-脂氧合酶结合的小分子化合物初始的量[12]。

1.2.3 高效液相色谱以及质谱检测条件

色谱柱为SunFireTMC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，I.D.5.0 μm)，检测器：2998二极管阵列检测器，流动相：水(A)和乙腈(B)，洗脱梯度：0～10 min，3%～3% B；10～40 min，3%～65% B；40～60 min，65%～100% B，检测波长：254 nm，进样量：10.0 μL。

利用六通阀联接质谱与液相色谱二极管阵列检测器(DAD)，选择大气压化学电离离子源(APCI)为质谱离子源，扫描范围为150～4 000；采用正离子分析模式；离子阱压力为3.10 × 107Pa；鞘气辅助气为高纯度N2。液相色谱参数同上述高效液相色谱参数。

1.2.4 数据统计与分析

每组实验重复3次，结果用“平均值±标准差”表示；采用Design-Expert软件中Box-Behnken组合对实验数据进行方差分析(ANOVA)；采用Matlab软件优化超声提取鹰嘴豆中异黄酮工艺参数；Design-Expert8.0.6软件设计组合实验以及绘制响应面图形，利用Origin进行单因素实验绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

超声提取鹰嘴豆异黄酮的单因素实验，结果如图2所示。超声时间在0～1.5 h内鹰嘴豆异黄酮提取率逐渐增加，超时时间大于1.5 h后提取率逐渐降低。提取时间为1.5 h时，鹰嘴豆异黄酮提取率达到最大值。由于超声破坏了鹰嘴豆的细胞壁和细胞膜，导致鹰嘴豆细胞内异黄酮大量溶出，因此超声时间越长，异黄酮的溶出率越高，随提取时间的继续增加，鹰嘴豆细胞组织中大量细胞破裂，其他杂质的溶出，影响鹰嘴豆异黄酮的溶出率[13]，因此最佳超声时间为1.5 h。

鹰嘴豆异黄酮的提取率在乙醇体积分数为30%～70%时，随着乙醇浓度的增加逐渐升高，当乙醇浓度大于80%时，提取率逐渐降低。该现象可能由于乙醇浓度增加，异黄酮的溶解度逐渐降低引起的。异黄酮一般易溶于高浓度有机溶剂，但异黄酮苷一般易溶于低浓度乙醇等有机溶剂。异黄酮苷在超声提取条件下不易分解，因此在乙醇体积分数为35%～75%时，提取率逐渐增加，当乙醇浓度继续增加时，将不利于鹰嘴豆中大量的异黄酮苷的溶出，因此提取率会降低[14]，因此最佳乙醇体积分数的为75%。

鹰嘴豆异黄酮提取率在料液比1∶10.0至1∶25.0 g/mL之间呈现逐渐增加的趋势，是因为随着料液比的增加，鹰嘴豆和溶剂之间的浓度差增加，加速异黄酮的溶出。当料液比大于1∶25.0时，乙醇体积过多时也可能造成其他物质的渗出，影响异黄酮的溶出[15]。因此最佳料液比为1∶25.0 g/mL。

图2 超声时间、乙醇体积分数、和料液比对异黄酮提取率的影响

2.2 响应面分析实验结果

鹰嘴豆异黄酮的提取条件选取超声时间、乙醇体积分数和料液比3个因素，根据Box-Behnken实验原理，利用Design-Expert程序，设计三因素三水平的响应面实验。利用响应面优化鹰嘴豆异黄酮的最佳提取条件，并拟合出相应的函数，结合神经网络进行进一步优化。利用响应面拟合得到的函数为：

Y=0.74+0.04A+0.05B+0.02C+0.04AB-0.03BC-0.06A2-0.10B2-0.14C2

(3)

所选用的二次多项模型P<0.05，R2=0.92，说明该模型二次方程显著，本方法可靠，对模拟分析三因素三水平实验条件是可行的。并且f>0.05为模型项显著。

2.3 遗传算法优化实验结果

利用 Matlab R2018b软件中的遗传算法优化工具箱，在响应面所构建的拟合函数的基础上，以鹰嘴豆异黄酮提取率为遗传算法的适应度函数。经过N迭代后，适应度函数值趋向适应度最高的个体[16]，即鹰嘴豆异黄酮提取率的最大值。由图3可见，当迭代13次时，群体的适应性函数变化趋势达到最大值0.76，即鹰嘴豆异黄酮提取率最大值为0.76 mg/g，此时超声时间(X1)、乙醇体积分数(X2)、和料液比(X3)水平编码分别为0.47、0.36和-0.02，即实验水平分别为1.73 h、78.64%和1∶24.9 g/mL。在此条件下，提取鹰嘴豆中异黄酮的成分，所得异黄酮含量理论值为0.76 mg/g。响应面与遗传算法相结合对鹰嘴豆最佳提取工艺进行优化，能较准确地优化鹰嘴豆异黄酮的最佳提取条件。

图3 遗传算法优化结果

2.4 超滤-质谱技术筛选鹰嘴豆5-脂氧合酶抑制剂

鹰嘴豆超滤实验的空白对照组以及分别与80.0 μL不同浓度的5-脂氧合酶(0.5、1.0和10.0 U/mL)结合的实验组HPLC图见图4。鹰嘴豆提取物中有5个成分可以与0.5、1.0和10.0 U/mL的5-脂氧合酶结合，对5-脂氧合酶存在一定的抑制作用，具有潜在的抗炎活性[17]。各活性成分与酶的结合强度用结合因子为，考察5个化合物与5-脂氧合酶的结合能力。由表2可知，5个活性成分对1.0 U/mL的5-脂氧合酶活性抑制效果显著，其中化合物5的结合强度最高，其次为化合物2、化合物3、化合物4和化合物1。通过超滤-质谱技术研究鹰嘴豆与5-脂氧合酶的抑制作用，操作简便，超滤-质谱技术具有高通量检测的优势，是一种快速高效的初步筛选复杂提取物中活性成分的手段，具有低成本、操作简单等优势。

表2 鹰嘴豆提取物与5-脂氧合酶的结合强度/%

注：a为空白组实验，b、c、d分别为酶浓度0.5、 1.0、10.0 U/mL的实验组。图4 鹰嘴豆提取物与不同浓度5-脂氧合酶结合的HPLC图

2.5 液-质联用技术初步鉴定鹰嘴豆中化学成分

利用液-质联用技术对鹰嘴豆提取物中的化学成分进行初步的分离与鉴定，通过质谱信息与标准品比对，分析鹰嘴豆中的化学成分的信息，结果如表3。利用液-质联用技术对鹰嘴豆提取物中活性成分进行初步鉴定和解析，根据各化合物的保留时间、分子离子以及碎片离子等信息，鉴定5个具有抑制5-脂氧合酶活性的异黄酮类化合物分别为大豆苷、大豆苷元、毛蕊异黄酮、后莫紫檀素和鹰嘴豆芽素A[19-22]。

表3 LC/MS法初步鉴定鹰嘴豆提取物中的化学成分

3 结论

利用遗传算法结合响应面优化鹰嘴豆中异黄酮的提取工艺，优化得到最佳提取工艺为：提取时间为1.73 h、乙醇体积分数为78.64%和料液比1∶24.90，在此条件下，鹰嘴豆中异黄酮提取率为0.76 mg/g。利用超滤质谱法筛选出鹰嘴豆中5个具有抑制5-脂氧合酶的活性成分，5-脂氧合酶活度为1.0 U/mL时，抑制酶的活性效果显著，鹰嘴豆芽素A与5-脂氧合酶结合度最高。