金雀异黄素缓解免疫抑制大鼠运动性疲劳的作用研究

董佳萍， 杨 琪， 谢琳琳， 王鹤霖， 刘殊凡， 迟晓星

(黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319)

运动性疲劳是人体脑力和体力持续活动到一定阶段时出现的一种生理现象，表现为机体生理过程不能维续其机能在特定水平上和(或)不能维持预定的运动强度[1]。机体的疲劳与免疫能力互相影响。免疫力低下时常伴随会疲劳感，而长时间的疲劳也同样容易引起机体的免疫力降低。因此，研究如何降低身体的疲劳感，确保人们能正常工作和健康生活变得至关重要。

金雀异黄素(Genistein)，又称为染料木素或染料木黄酮，是大豆异黄酮的主要成分，约占大豆中总异黄酮的60%[2]。金雀异黄素是植物雌激素中活性较强的一种，研究表明其具有抗氧化性、抗炎活性、抗肿瘤、保护骨骼肌等功效[3-7]。

目前对于金雀异黄素的抗疲劳与提高免疫力分别有所研究。麻海娟等[8]研究发现，金雀异黄素可显著上调大鼠脾、胸腺、肾和脑的脏器指数，同时明显提高血清中的NO和NOS含量。蒙兰兰等[9]研究发现，金雀异黄素可升高运动性疲劳大鼠全血中红细胞、白细胞和淋巴细胞计数,升高血红蛋白浓度。均说明金雀异黄素具有缓解大鼠运动性疲劳的作用。陈晓蛟[10]研究发现，金雀异黄素可以提高小鼠血清中总IgE、TSLP含量及BALF中IL-4、IL-13细胞因子水平，达到提高免疫力作用。但以上研究都是基于单独模型的研究，本实验以金雀异黄素为受试物，建立免疫抑制模型，通过游泳训练后测定大鼠血清、肝组织及骨骼肌中的疲劳相关指标，探讨金雀异黄素对免疫抑制大鼠运动疲劳的影响，为进一步阐明缓解疲劳作用机制。为金雀异黄素的进一步研究利用提供数据支持，为开发缓解疲劳类型的保健品提供新的思路和方向。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

金雀异黄素(纯度98%)，环磷酰胺，贞芪扶正颗粒，肝/肌糖原试剂盒、尿氮素(BUN)试剂盒、乳酸(LD)试剂盒、蛋白定量试剂盒。

DK-8D型水浴锅，TGL-16B台式离心机，TG-16M低温冷冻离心机，5424高速离心机，Multiskan Sky全波长酶标仪，T6型紫外可见分光光度计；SH-250电热恒温培养箱。

1.2 动物与分组

选取72只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，体重(200±20)g，生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001。大鼠自由饮食，在温度(20±2) ℃，相对湿度(40～60)%的环境下饲养。大鼠按体重随机分为6组，每组12只，分别为空白对照组、免疫抑制模型组、金雀异黄素低、中、高剂量组以及阳性对照组。

所有动物实验均按照黑龙江八一农垦大学动物科学学院动物伦理委员会的批准，按照当地机构要求进行。

每天9:00进行灌胃处理。其中，空白对照组和免疫抑制模型组给予花生油灌胃，低、中、高组灌胃剂量为10、20、40 mg/kg，阳性对照组剂量为贞芪扶正颗粒3.13 g/kg，连续灌胃21 d。此外，大鼠每天14:00进行游泳训练1次，训练时用玻璃棒搅动水面，以避免大鼠漂浮偷懒。

1.3 方法

1.3.1 免疫抑制模型建立

适应性喂养一周后，空白对照组大鼠腹腔注射生理盐水，其余组大鼠腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg，每日1次，连续3 d[11]。

1.3.2 大鼠游泳训练实验

适应性喂养1周后，在直径为50 cm、水深为50 cm的塑料圆桶中进行大鼠游泳训练，水温保持在(24±1)℃。第1天起开始训练时间为30 min，以后逐日递增10 min，加至80 min维持此训练量至实验结束。剔除不会游泳的大鼠后随机分组。游泳时用塑料棒驱赶使之不停的游泳，各实验组大鼠置于水中不互相接触且每只鼠尾部不与箱底碰触，用吹风机将游泳后的大鼠皮毛迅速干燥。

1.3.3 力竭游泳时间测定

每组大鼠采用急性力竭负重游泳实验。于末次给药后1 h，每组随机抽取6只大鼠，在大鼠尾部缚大约为体重5%的铅皮，然后放入水深50 cm、直径50 cm的塑料圆桶，水温维持在(24±1)℃。力竭的时间根据从游泳实验开始直至沉入桶底后10 s不浮出水面进行计算，比较各组大鼠负重游泳至力竭的时间。

1.3.4 指标检测及方法

大鼠末次灌胃后，各组大鼠禁食12 h，不禁水，称量体重后将剩余36只大鼠进行游泳训练，大鼠进行50 min游泳训练，休息30 min后乙醚麻醉处死，腹主动脉取血3 500 r/min下离心15 min后取上清。大鼠处死后取肝脏、骨骼肌等组织备用。分别按照试剂盒说明书测定指标。

1.3.5 统计学分析

数据采用SPSS 21进行单因素方差分析，采用LSD法进行多重比较，数据均以均值±标准差(x±s)表示，以组间方差分析P<0.05为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 金雀异黄素对大鼠脏器指数影响

由表1可知，与空白对照组相比，模型组的胸腺指数显著下降(P<0.01)，提示成功建立免疫抑制模型。与模型组比较，金雀异黄素高剂量组和阳性对照组的大鼠胸腺指数显著升高(P<0.01)，金雀异黄素各剂量组大鼠的脾脏指数有所提高，但差异不显著(P>0.05)。金雀异黄素剂量组大鼠脾脏、肾脏和肝脏指数较模型组和空白对照组无显著差异(P>0.05)。结果表明，金雀异黄素对免疫抑制大鼠胸腺损伤有一定的改善作用。

表1 金雀异黄素对大鼠脏器指数影响

2.2 金雀异黄素对大鼠力竭游泳时间的影响

由表2可知，与模型组相比，金雀异黄素剂量组和阳性对照组可显著提高力竭游泳时间(P<0.01)。与空白对照组相比，金雀异黄素中、高剂量组和阳性组大鼠平均力竭游泳时间差异极其显著，其中高剂量组力竭游泳时间延长了50.4%(P<0.01)。结果表明，金雀异黄素可延长免疫抑制大鼠的力竭游泳时间，且力竭游泳时间与金雀异黄素剂量呈正相关。

表2 金雀异黄素对大鼠负重力竭游泳时间的影响

2.3 金雀异黄素对大鼠肝糖原和肌糖原含量的影响

由表3可知，补充金雀异黄素各剂量组的免疫抑制大鼠运动后肝糖原与肌糖原含量明显提高。其中，与空白对照组相比，金雀异黄素低剂量组大鼠运动后的肝糖原水平有显著差异(P<0.05)。与模型组相比，肝糖原含量有所增加但无统计学差异。金雀异黄素中、高剂量组和阳性对照组的肝糖原含量与模型组相比显著提高，且差异极其显著(P<0.01)。金雀异黄素各剂量组大鼠肌糖原水平均极其显著的高于模型组(P<0.01)。结果表明，金雀异黄素在20～40 mg/kg时，可以有效提高免疫抑制大鼠运动后的糖原水平，进而达到提高大鼠的运动耐力。

表3 金雀异黄素对大鼠肝糖原和肌糖原含量的影响

2.4 金雀异黄素对大鼠血清中尿素氮和乳酸含量的影响

由表4可知，金雀异黄素对实验大鼠血清中的尿素氮含量和乳酸含量有明显的影响，且与金雀异黄素的浓度呈负相关。其中，模型组大鼠血清中尿素氮含量和乳酸含量显著高于空白对照组(P<0.01，P<0.05)，提示成功建立大鼠免疫抑制模型。与模型组相比，金雀异黄素低剂量组尿素氮含量及乳酸含量无统计学差异。中剂量组尿素氮含量则显著地低于模型组(P<0.05)，乳酸含量极显著低于模型组(P<0.01)；高剂量组和阳性对照组极显著地低于模型组(P<0.01)。结果表明，金雀异黄素可以抑制尿素氮含量的增加，同时减少乳酸的产生。

表4 金雀异黄素对大鼠血清中尿素氮和乳酸含量的影响

3 讨论

现代医学对疲劳的治疗有限，已有学者研究具有抗疲劳作用的潜在替代品，包括传统中草药及预防疾病和促进健康的药用或功能性食品[12]。目前针对缓解疲劳其体内分子机制的认识十分有限，人们逐渐关注功能性食品或传统药材潜在替代品，进行研究以期解决这些复杂机体问题并用于改善健康状况。

胸腺和脾脏是机体的主要免疫器官，其质量的改变可以反映受试药物对免疫系统的刺激作用[13]。有学者研究指出，黄酮类化合物可以通过免疫系统调节作用提高机体耐受能力，减缓肌肉的损伤、能量的过度损耗，达到抗疲劳作用[14]。本实验结果表明，模型组大鼠胸腺指数显著低于正常对照组，表明环磷酰胺抑制了大鼠的胸腺生长发育，造成脏器损伤，而补充金雀异黄素高剂量组和阳性组可不同程度提高大鼠胸腺指数(P<0.05)。结果与麻海娟等[8]在金雀异黄素对运动疲劳大鼠脏器指数及NO/NOS的影响研究中得到的结论相同，运动疲劳大鼠经金雀异黄素干预后，胸腺指数均明显上调。提示金雀异黄素能减轻环磷酰胺对胸腺的生长抑制作用，可以促进免疫器官分化和成熟进而提高免疫能力，从而达到缓解疲劳的效果。

运动耐力实验是检测抗疲劳能力最直接的方式，通过力竭游泳时间的长短可以反映出运动耐力的大小[15-17]。本实验采用力竭游泳试验测试大鼠抗疲劳能力，结果表明，给予大鼠不同剂量金雀异黄素可延长大鼠的力竭游泳时间，增强耐力。与王玲玲[18]研究结果具有一致性，分析原因可能是金雀异黄素吸收后，提高大鼠有氧代谢能力，从而增强耐力起到延缓疲劳的效果。

机体活动需要能量，糖原是机体主要的能源储备，糖原含量的多少直接影响运动能力的强弱[19]。在剧烈运动时，肝糖原直接转化为糖对机体进行供能，肌糖原则可以通过无氧酵解为肌肉供能，从而延长运动时间，推迟疲劳反应[20]。因此，肝糖原和肌糖原通常作为评价机体抗疲劳的指标[21]。本实验结果表明，模型组大鼠肝糖原含量较空白对照组显著降低，说明免疫抑制大鼠较正常运动大鼠肝糖原消耗更迅速。在给予金雀异黄素后，肝糖原和肌糖原含量较模型组显著增加。夏春荣等[22]和孔凡秀等[23]学者研究结论均表明通过延迟肝糖原和肌糖原的消耗可以达到抗疲劳作用，与本研究结论一致。分析原因为金雀异黄素可能通过减少运动时机体糖原消耗或者提升糖原储备，持续为机体提供能量，进而延缓疲劳的产生达到抗疲劳效果。

常规情况下，血清中尿素氮含量相对稳定，当机体进行高强度运动时，由于体内糖类和脂肪供能不足，蛋白质和氨基酸会进行分解代谢以提供能量，此时会产生代谢物导致血清中尿素氮水平升高。尿素氮累计越多表示机体疲劳越严重[24]。研究表明，乳酸的蓄积是导致运动性疲劳的重要原因，大量乳酸堆积使得肌肉内pH值下降，从而抑制酶活性致使能量供应不足[25]。Zhang等[26]研究发现，玉米须总黄酮可通过降低血乳酸含量发挥抗疲劳功效。陈战永等[27]研究结果也表明通过减小乳酸与尿素氮生成量进而提高小鼠抗运动疲劳能力。邓炳楠[28]在大豆异黄酮抗疲劳作用的研究中表明通过降低尿素氮与乳酸含量，达到抗疲劳效果，与本实验结论具有一致性。表明金雀异黄素可以通过减少尿素氮含量，提高大鼠运动能力并缓解疲劳。同时可以减少乳酸的产生，降低运动后导致的肌肉损伤，从而延缓疲劳的产生，且成剂量依赖性。由于实验动物之间存在个体差异，分组数量也会导致结论具有一定的局限性。但本实验得到结论与前人研究结果相似，从而说明金雀异黄素对免疫抑制大鼠有缓解疲劳的效果。

4 结论

金雀异黄素能提高免疫抑制大鼠的胸腺指数，明显延长实验大鼠力竭游泳时间，维持肝脏和肌肉中糖原含量，降低大鼠血清中尿素氮含量和乳酸含量。说明，金雀异黄素可以通过提高大鼠脏器指数，从而提高免疫力。通过提高免疫抑制大鼠的运动耐力，促进糖原产生，减少乳酸堆积，达到缓解疲劳的作用效果。金雀异黄素在较高剂量(40 mg/kg)可显著提高实验大鼠耐力及调节血清和骨骼肌中疲劳相关生化指标的水平，具有较好的缓解疲劳的功效。