甲氧基聚乙二醇2000-氢化大豆磷脂酰乙醇胺的制备及性能探究

于殿宇， 张寅风， 高佳佳， 曲佳瑶， 吉晓蕊， 罗淑年，张晨晨， 杨福明,2， 朱秀清,3

(东北农业大学食品学院1，哈尔滨 150030) (九三食品股份有限公司2，哈尔滨 150069) (哈尔滨商业大学食品学院3，哈尔滨 150028)

脂质体是一种人工膜，是一种封闭的球形囊泡，通常含有一层或多层磷脂双分子层[1]，具有无毒无害、无免疫原性、易实现靶向性等特点，从20世纪70年代开始用作药物载体[2]。磷脂是脂质体制备的重要原料，在医药、食品、化妆品等加工行业中应用广泛。磷脂包括天然磷脂和合成磷脂，但人工合成的磷脂制备过程复杂，成本较高，动物磷脂中含有胆固醇，人体摄入过多容易诱发疾病，安全性难以保证[3]，不宜用在药物中。随着磷脂在医学方面应用范围的不断增加，制药业对纯度高的天然植物磷脂的需求不断增大[4]。

非转基因的大豆浓缩磷脂多用于生产卵磷脂[5]，其副产物中的磷脂酰乙醇胺(PE)安全健康、价格低廉，对提高记忆力、增强大脑机能、调节血脂有益[6，7]。但磷脂酰乙醇胺相关产品不稳定，应用受限[8]，为了使其具有优良性质，需要进行改性处理。磷脂氢化改性可以使油脂稳定性提高，亲水性增强[9]。

催化加氢法是通过高温和催化剂来催化油与氢的反应，但是PE中的乙醇胺对催化剂有抑制作用，且温度较高会导致反式脂肪酸的形成[10]。超临界CO2氢化法对PE改性可以克服通过高温和催化剂加氢的弊端，有效减少反式脂肪酸的形成[11]，还有助于加快反应速率，提高催化剂活性，得到的产品碘价低、色泽浅、储藏稳定性好[12]。

聚乙二醇是一种亲水性聚合物，在脂质体膜上插入带有水溶性聚合链的聚合物,可以获得更长的血循环时间[13]。相关研究表明，分子质量为2 ku的甲氧基聚乙二醇MPEG表现出最佳性能[14]。为避免修饰分子时产生交联，采用一端以甲基封闭的MPEG[15]。

目前，利用插入PEG基团的脑磷脂生产的药物载体得到了广泛的应用，Rupa等[16]用PEG2000-PE/TPGS混合胶束结合难溶性抗癌物药物紫杉醇后提高了生物利用率；Su等[17]探究奥曲肽- peg - dspe的合成，为制备明确的药物传递系统提供了靶向分子；Mitra等[18]探讨开发PLA-PCL-PEG-PCL-PLA胶束改善了地塞米松的眼通透性。但是，直接用磷脂制成的脂质体氧化稳定性还有待提高[19]。

本研究以非转基因的大豆浓缩磷脂生产卵磷脂过程中的副产物为原料，采用化学合成法制备一种性价比更高的药用辅料MPEG2000-HSPE，并对产品性能进行研究，以期提高PC的副产物综合利用价值。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

浓缩磷脂(酸价：16.75 mg KOH/g，碘价：79.75 gI2/100 g，水分及可挥发物0.75%，丙酮不溶物60.33%，乙醚不溶物0.07%)。聚乙二醇单甲醚2000；氢气、二氧化碳、氮气(纯度≥99%)；Pd/C催化剂；溴乙酸叔丁酯(98%)；二氯亚砜(SOCl2，99%)。

1.2 磷脂酰乙醇胺的纯化

对PC副产物进行溶剂萃取，得到高纯度的PE。首先采用95%的乙醇，在料液比为1∶3，温度为-13 ℃的条件下去除副产物中的PC；再用90%的石油醚，在料液比为1∶4，温度为30 ℃的条件下进行萃取，去除肌醇等其他磷脂，最终得到粉状淡黄色磷脂酰乙醇胺[20]。

1.3 磷脂酰乙醇胺的氢化

将纯化后的PE充分溶解于无水乙醇的混合溶剂中，与Pd/C催化剂仪器加入密封好的反应釜，向内通入CO2并对反应釜进行试漏。确定反应釜密封状态良好后排出反应釜中的CO2，再充入CO2，反复3～5次以置换出反应釜中的空气，从而保证氢化反应的安全进行。最后一次先后充入CO2和H2，使釜内总压为11 MPa[21]。搅拌、升温，保持恒定的氢化条件至一定反应时间。氢化结束后降温降压，放出反应釜内气体，转移反应产物于烧杯中。在55 ℃条件下旋蒸去除溶剂，最后干燥获得成品。

1.4 聚乙二醇单甲醚2000酰氯的合成

图1为聚乙二醇单甲醚2000合成聚乙二醇单甲醚2000酰氯的全过程。将干燥的聚乙二醇单甲醚MPEG2000全部溶解于无水二氯甲烷溶液中，通入N2后加氢氧化钠固体反应，然后加入溴乙酸叔丁酯，得到羧基聚乙二醇单甲醚2000。将其加入到二氯甲烷中，再向反应体系中加入二氯亚砜，得到白色固体即为聚乙二醇单甲醚2000酰氯。

图1 mPEG2000合成聚乙二醇单甲醚2000酰氯全过程

1.5 磷脂酰乙醇胺的培化

将氢化磷脂酰乙醇胺与聚乙二醇单甲醚2000酰氯的溶于一定量氯仿中，加入三乙胺进行反应，在适宜温度为条件下反应一段时间后将未反应的三乙胺和氯仿蒸除，将获取的固体减压干燥，后将未反应的聚乙二醇单甲醚2000酰氯通过无水乙醚去除，真空干燥称重，最终得到MPEG2000-HSPE[22]。而后将三乙胺盐酸盐通过四氢呋喃沉淀出来，离心分离，将离心管下层固体真空干燥后进行称重，用于计算MPEG2000酰氯的转化率。

1.6 产品理化性质测定

1.6.1 分散力的测定

标准硬水的配制：一般依据碳酸钙来表示硬度，计为0.342 mg/mL，称取无水CaCl2颗粒0.304 g及0.13 g的MgCl2-6H2O置于1 000 mL的容量瓶内，再利用蒸馏水定容至刻度线。取1 mg/mL的试样、4 mg/mL的油酸钠及硬水于容量瓶中(100 mL)，三者的加量分别为50、5、10 mL，加蒸馏水定容后摇匀，定容后立即用波长λ为700 nm的光和1 cm比色槽测定其吸光度，同时与空白样传统药用辅料(MPEG2000-SPE)对比，以此来判断样品的分散力[23]。

1.6.2 碘值的测定

采用A. S. Sarpal B的方法测定碘值。

1.6.3 乳化性的测定

用50 mL的蒸馏水溶解0.05 g培化磷脂酰乙醇胺，置于100 mL的具塞三角瓶内，再量取50 mL的正己烷，放置于振荡速率为105 r/min的水浴恒温振荡器中5 min，测定正己烷与水分散10 mL消耗的时间[24]，重复测定3次取平均值，并与同样条件下测定的MPEG2000-SPE样品作对比。

1.7 数据分析

本实验获取的数据，用3次重复实验取得的平均值来表示，采用 SPSS 16.0 软件进行方差分析以及多重比较分析，并利用 Origin 9.0 软件处理实验所得数据及绘图。

2 结果与分析

2.1 磷脂酰乙醇胺纯化

用乙醇冷冻萃取，获得PE纯度为78.44%，得率为89.32%，与Heikki等[25]的结果相似；最后经过石油醚的萃取，在此工艺条件下浸提的磷脂酰乙醇胺液相色谱图如图2所示，磷脂酰乙醇胺纯达到91.28%，PE得率为86.83%。

图2 纯化后的样品液相色谱图

2.2 磷脂酰乙醇胺的超临界CO2氢化工艺

2.2.1 催化剂用量对PE超临界CO2氢化的影响

图3 催化剂添加量对超临界CO2氢化PE的影响

在氢化温度为60 ℃， 氢气分压为4 MPa，CO2分压为7 MPa，搅拌速度为300 r/min的条件下氢化120 min，催化剂添加量对磷脂酰乙醇胺中的反式脂肪酸及碘值的影响如图3所示。随着氢化催化剂添加量的增加，氢化PE的反式脂肪酸匀速上升，而碘值先迅速降低后趋于平缓，这是因为在催化剂含量较少时，可以形成的金属-氢及金属-双键配合物含量较少，得到的半氢化中间体也很少，此时增加催化剂的添加量，会显著增加催化反应速率；当催化剂添加量在4%以上时，随着催化剂用量增加，产品碘值下降不大但反式脂肪酸的含量显著增大[26]。综合考虑氢化反应产物和成本，选择氢化催化剂添加量为磷脂质量的4%。

2.2.2 氢化温度对PE超临界CO2氢化的影响

在催化剂添加量为4%，氢化温度分别为50、60、70、80、90、100 ℃，氢气分压为4 MPa，CO2分压为7 MPa，搅拌速度为300 r/min的条件下氢化120 min，得到的不同氢化温度对超临界CO2氢化反应的影响，氢化温度对超临界CO2氢化PE的影响如图4所示。

图4 氢化温度对超临界CO2氢化PE的影响

从图4可以看出，随着氢化温度的增加，氢化磷脂酰乙醇胺碘值先快速下降后趋于平缓，氢化磷脂酰乙醇胺中的反式脂肪酸含量先缓慢升高后快速升高。氢化反应是放热反应，适当地加热有利于氢更好地溶解于溶剂中，催化剂得以充分还原和活化，此外，在超临界CO2条件下，反应中的气液之间的传质阻力可大大降低，反应速率增加。当温度太高时会导致催化剂表面氢分布不充分从而降低反应速度，造成磷脂的变质。当催化温度为60 ℃时，碘值变化的显著性下降，反式脂肪酸含量的变化显著增加。综合考虑，实验选取最适氢化温度为60 ℃[27]。

2.2.3 氢化时间对PE超临界CO2氢化的影响

在催化剂添加量为4%，氢化温度为60 ℃，氢气分压为4 MPa，CO2分压为7 MPa，搅拌速度为300 r/min，氢化时间分别为80、90、100、110、120、130 min，得到不同氢化时间对超临界CO2氢化反应的影响，氢化时间对超临界CO2氢化PE的影响如图5所示。

图5 氢化时间对超临界CO2氢化PE的影响

由图5可以得出，随着氢化时间的延长，氢化PE的碘值先迅速下降后趋于平稳，这是因为在氢化反应刚开始阶段，PE的不饱和程度还比较高，反应物较为充足，反应速度较快，但是随着时间的继续延长，PE中能够被催化剂表面活性点吸附的双键减少，氢气在催化剂表面不断被消耗，催化剂也不断钝化，所以在120 min后氢化PE的碘值虽然不断下降，但反应速度降低，原因是磷脂酰乙醇胺中能够被催化剂表面活性点吸附的双键减少，反应速度减小；此外，生成的半氢化中间体有一部分生成了较为稳定的反式脂肪酸，其与顺式脂肪酸相比不易被氢化。综合考虑，氢化时间选取120 min为宜[28]。

2.2.4 氢化分压力对PE超临界CO2氢化的影响

在催化剂添加量为4%，氢化温度为60 ℃，氢气分压分别为1、2、3、4、5、6 MPa，CO2分压为7 MPa，搅拌速度为300 r/min的条件下氢化120 min。氢化分压对超临界CO2氢化磷脂酰乙醇胺碘值和反式脂肪酸的影响如图6所示。随着氢气分压的增加，氢化PE的碘值呈现下降趋势，且由于增大氢气压力增大了催化剂表面氢气的浓度使得反式脂肪酸含量降低。但是氢气分压超过4 MPa以后，虽氢化PE中反式脂肪酸继续缓慢下降但碘值下降的不明显。这是因为在一定的氢气分压范围内，随着氢气分压的增大，溶解于溶剂中的氢含量也随之增加，有利于氢化反应的进行，但是随着氢气含量的进一步增加，溶解于溶剂中的氢气已经达到饱和，此时继续增加氢气分压，并不能有力地促进氢化反应的进行，故选择氢气分压为4 MPa较为合适[29]。

图6 氢气分压对超临界CO2氢化PE的影响

最终确定超临界CO2氢化条件为：催化剂添加量为4%，氢化温度分别为60 ℃，氢气分压为4 MPa，CO2分压为7 MPa，搅拌速度为300 r/min的，氢化时间为120 min。在此条件下，所得磷脂酰乙醇胺碘值含量下降，稳定性有所增强。

2.3 磷脂酰乙醇胺的培化工艺

探究了物料比、反应温度、反应时间、三乙胺添加量对聚乙二醇单甲醚2000酰氯转化率的影响，实验结果如图7所示。

从图7中可以看出，随着氢化磷脂酰乙醇胺的含量逐渐增加，聚乙二醇单甲醚2000酰氯的转化率呈现明显增加的趋势，当物料比大于3.5∶1时，转化率上升缓慢，原因可能为体系中的聚乙二醇单甲醚2000酰氯充分发生反应，相对而言加入过多的HSPE对反应无较大影响。随着温度的升高，此时温度促进反应的进行，产物的转化率显著增加[30]；当温度超过50 ℃时，转化率增加缓慢，同时过高的温度会造成氢化磷脂酰乙醇胺的变性。随着反应时间的增加，分子之间更容易接触，产物的转化率随之增加。当反应时间达到4 h时，体系中的反应物已充分反应，浓度较低，即使延长反应时间产物的产率也不会发生较大改变[31]。聚乙二醇单甲醚2000酰氯与HSPE反应生成HCl，加入的三乙胺可以与HCl结合生成三乙胺盐酸盐，从而催化反应的进行。随着三乙胺添加量的增加，聚乙二醇单甲酸2000酰氯转化率逐渐增加，当三乙胺用量为3 mL时，聚乙二醇单甲醚2000酰氯的转化率为83.64%，随着三乙胺添加量的进一步增加，其转化率增加较小[32]。因此，MPEG2000-HSPE的最佳培化条件为：物料为3.5∶1，温度为50 ℃，反应时间为4 h，三乙胺添加量为3 mL。

图7 反应条件对聚乙二醇单甲醚2000转化率的影响

2.4 MPEG2000-HSPE产品红外分析结果

对磷脂酰乙醇胺、氢化磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇单甲醚2000酰氯及MPEG2000-HSPE四种载体进行FT-IR特征吸收峰检测，结果如图8所示。

2.5 培化磷脂酰乙醇胺的理化特性

2.5.1 MPEG2000-HSPE的分散性

乳状液中分散相会自发地向着凝聚的方向前进，为了维持体系的稳定需要借助分散力的存在来阻止，因此，实验应对产品的分散性能进行测定。表1是在λ=700 nm，b=1 cm条件下，MPEG2000-SPE和MPEG2000-HSPE的吸光度的测定结果。吸光度越小一定程度上也就意味着物质的分散性能越好[32]。从表1可以看出MPEG2000-HSPE比MPEG2000-SPE的吸光度要小很多，说明MPEG2000-HSPE具有更好的分散性，改性方法有效的改变了粒子表面性质，降低了界面能，避免粒子之间的聚集，最终可以维持乳化液稳定性。

2.5.2 MPEG2000-HSPE的碘值含量

碘值常用来反映化合物的氧化稳定性，不饱和程度越小，碘值越低，样品就越稳定。由表2可以看出，MPEG2000-HSPE比传统的脂质体原料MPEG2000-SPE饱和程度更高，抗氧化能力更强。

表2 MPEG2000-SPE和MPEG2000-HSPE碘值比较

2.5.3 MPEG2000-HSPE的乳化性

乳化力是衡量表面活性剂乳化能力的一项重要指标，表3为MPEG2000-SPE和MPEG2000-HSPE使水-正己烷两相分开10 mL所耗费的时间[34]。从表3中可以看出，MPEG2000-HSPE的分离时间远超于MPEG2000-SPE，说明改性后培化的磷脂酰乙醇胺乳化稳定性更好。

表3 MPEG2000-SPE和MPEG2000-HSPE乳化性比较

3 结论

将非转基因的大豆浓缩磷脂生产脑磷脂过程中的副产物进行纯化，成功得到了纯度高的磷脂酰乙醇胺。将纯化后的产物进行超临界CO2氢化，在催化剂用量为4%，氢化时间为120 min，较低温度条件下，所得产品的碘值为23.27 gI/100g， 且产品TFAs含量较低。利用氢化后的产物与聚乙二醇2000酰氯合成MPEG2000-HSPE，转化率为84.63%。红外光谱分析表明，聚乙二醇单甲醚2000酰氯与HSPE成功聚合，产生了—NH，产物中存在MPEG2000-HSPE。与传统药用辅料MPEG2000-SPE相比，最终产物碘值含量低、分散性能好、状态稳定、亲水性增强。