反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的研究进展

秦 帆，盛光遥，李长鑫，汤明芳，何岸飞，姜 晶，丁 静

（苏州科技大学环境科学与工程学院，江苏 苏州 215009）

甲烷（CH4）是一种温室气体，其温室效应能力是CO2的20～30倍，对 全 球变暖的贡献率约 为22%〔1〕。自然环境中的甲烷主要来源于有机物的厌氧氧化，但大部分甲烷在到达大气圈之前已经通过微生物的好氧氧化和厌氧氧化过程被消耗。其中，厌氧甲烷氧化（AOM）过程可以结合多种电子受体，最早根据地球化学质量平衡计算得出。硫酸盐是海洋环境中主要的电子受体之一〔2-4〕，硫酸盐型厌氧甲烷氧化（SAMO）是海洋环境中主要的甲烷汇。之后，AOM也被发现可以以硝酸盐/亚硝酸盐〔5〕、铁（水铁矿）/锰（水钠锰矿）〔6〕和腐殖酸〔7-8〕作为电子受体。在淡水湿地中，AOM每年约消耗2×108t甲烷，可减少50%以上的潜在甲烷排放量〔9〕。因此，AOM是控制和调节淡水、海洋环境中甲烷循环和排放的关键过程。

在淡水环境中，硫酸盐浓度较低，且由于现代农业生产中氮肥的大量施用，NO3-/NO2-成为淡水环境中AOM的主要电子受体。并且，反硝化型厌氧甲烷氧化（DAMO）过程已具备热力学与生物化学理论基础〔10〕，化学方程式表述如下：

但直到2006年，A.A.RAGHOEBARSING等〔5〕才通过富集培养发现了AOM耦合反硝化的实验证据，他们利用克隆测序和荧光原位杂交（FISH）技术在富集菌群中成功检测到了DAMO微生物。进一步地，当NO3-作为电子受体时，DAMO古菌和DAMO细菌共同代谢催化DAMO反应；当NO2-作为电子受体时，DAMO细菌则可单独催化DAMO过程〔1〕。Baolan HU等〔11〕研究发现，湿地环境中的亚硝酸盐型DAMO过程每年可消耗4.1×109～6.1×109kg甲烷，约占湿地环境中甲烷汇的2%～6%。因此，DAMO对于充分了解地球上的甲烷循环以及量化甲烷汇具有重大意义。同时，随着全球范围内氮污染的加剧，以氮化合物作为电子受体的DAMO过程值得更深入的研究。

DAMO微生物虽然在自然生境中分布广泛，但生长速度缓慢，倍增时间在2周以上〔12〕，富集时间一般在5～16个月〔13-15〕，限制了对其研究的广泛开展。目前，关于DAMO微生物的代谢机理、富集影响因素以及工程应用潜力等问题尚未完全清晰。推进DAMO研究有利于更好地认识碳氮元素生物地球化学循环、理解自然生境中甲烷循环及其对大气温室效应的贡献，同时也有利于探索其在废水生物脱氮过程中应用的可能性〔16〕。笔者主要集中介绍和总结了DAMO微生物的代谢途径、微生物富集的影响因素，以及DAMO在废水脱氮中的应用前景，同时提出DAMO未来的研究方向，以期为DAMO微生物的环境功能研究及废水脱氮处理应用提供参考。

1 DAMO微生物的代谢途径

目前，关于DAMO微生物代谢途径的研究尚处于起步阶段〔17〕。DAMO过程主要涉及2类微生物：DAMO古菌和DAMO细菌。DAMO古菌主要通过耦合“产甲烷的逆过程”（甲烷氧化）和硝酸盐还原来代谢甲烷，DAMO细菌则通过亚硝酸盐依赖型的“内部好氧”途径催化甲烷氧化〔18〕。

1.1 DAMO古菌厌氧氧化甲烷耦合硝酸盐还原途径

基于产甲烷过程所涉及的大部分酶促反应均可逆，S.HALLAM等〔19〕提出“产甲烷的逆过程”模型，并发现厌氧噬甲烷古菌（ANME）基因组中包含了产甲烷途径中除亚甲基四氢甲烷喋呤还原酶（Mer）基因（甲烷形成的关键基因）以外的所有功能基因。亚甲基四氢叶酸还原酶（MetF）基因与Mer结构类似，或许可以代替其功能促进AOM的发生〔20〕。DAMO古菌沿着甲烷产生的逆向过程进行甲烷氧化，氧化过程中释放的电子可用于硝酸盐还原。如图1所示〔21〕，甲烷在甲基辅酶M还原酶（Mcr）的作用下生成甲基辅酶M，再依次被甲基辅酶M转移酶（Mtr）和MetF（类似Mer）催化形成亚甲基-四氢甲基蝶呤，然后经过一系列的酶促反应最终被转化 为CO2〔21〕。其中，Mcr起活化甲烷 的 作用，Mcr及其镍离子辅酶F430是表征“产甲烷的逆过程”的重要标记物〔22〕。由于DAMO古菌仅含有硝酸盐还原酶的编码基因，并不含有反硝化后续步骤的相关编码基因，因此DAMO古菌只能进行部分反硝化，并需要DAMO细菌的协同作用，进一步将生成的亚硝酸盐转化为氮气。

图1 DAMO古菌“产甲烷的逆过程”耦合硝酸盐还原途径Fig.1 Pathway of DAMO archaea for reverse methanogenesis coupled with nitrate reduction

1.2 DAMO细菌“内部好氧”氧化甲烷耦合亚硝酸盐还原途径

随着研究的深入，K.F.ETTWIG等〔23〕发现，反硝化厌氧甲烷氧化过程并非完全依赖于逆向产甲烷途径。他们将富集后的培养物（DAMO细菌80%，DAMO古菌10%）接种到新的生物反应器中，并对其进行溴乙烷磺酸盐（BES）抑制实验。结果表明，DAMO活性并没有受到明显抑制。进一步的富集实验中，DAMO古菌逐渐消失，而DAMO细菌活性却没有下降，厌氧甲烷氧化速率仍保持在一个相对稳定的状态。这个现象的发现证实了DAMO细菌可以独立完成反硝化厌氧甲烷氧化过程。

K.F.ETTWIG等〔24〕在后续的DAMO细菌富集研究中发现，尽管体系中的氧浓度一直低于检出限（没有胞外氧），但宏基因组测序结果却显示DAMO细菌含有甲烷好氧氧化的关键酶——颗粒性甲烷单加氧酶（pMMO）和末端呼吸氧化酶，这意味着富集物内部有O2生成。他们因此提出了DAMO细菌的“内部好氧”亚硝酸盐依赖型甲烷厌氧氧化途径。同位素示踪实验表明，甲烷氧化活性只有在亚硝酸盐存在的情况下才能被激发〔24〕。如图2〔18〕所示，NO2-首先被亚硝酸盐还原酶还原为NO，然后2分子NO在一种未知的一氧化氮歧化酶作用下，被催化生成N2和O2；75%生成的O2被用于甲烷氧化，剩余25%的O2则被末端呼吸氧化酶消耗，即用于正常的呼吸作用。甲烷在多种酶的作用下被氧化为甲醛（HCHO），接着甲醛通过丝氨酸循环进入细胞合成代谢。同时，甲醛在多种酶的作用下最终被氧化为CO2和H2O。DAMO细菌的这种“内部好氧”甲烷厌氧氧化途径具有非常重要的生物学意义，说明地球上存在第4种生物产氧途径——绕过反硝化中间产物N2O直接将NO转化为N2和O2，即NO歧化酶取代了N2O还原酶，与多种氧化酶共同催化NO产生O2。然而迄今为止，反硝化过程中的一氧化氮歧化酶仍然未被发现。

图2 DAMO细菌“内部好氧”的亚硝酸盐依赖型甲烷厌氧氧化途径Fig.2 Pathway of DAMO bacteria for intra-aerobic nitritedependent anaerobic oxidation of methane

2 DAMO微生物富集的影响因素

2.1 接种物

接种物对DAMO微生物的富集有重要影响。在DAMO微生物的首次成功富集工作中，其接种物来源于荷兰特温特运河沉积物〔5〕，取样处污泥的甲烷浓度高达0.8 mmol/L，硝酸盐浓度为0.1 mmol/L，适宜作为DAMO反应器的接种污泥。对照实验亦证明了这一点：反硝化速率从无甲烷时的（5.5±0.5）μmol/h（以N2计）增至加入甲烷时的（21.5±2）μmol/h。此后的研究中，DAMO微生物接种物来源包括淡水河沉积物〔13，25〕、污水处理厂混合污泥〔14，26〕、淡水湖沉积物/厌氧污泥/活性污泥混合物〔27〕等（表1）。

表1 不同DAMO富集培养物的比较Table 1 Comparison of different DAMO culture enrichment

Zhanfei HE等〔32〕首 次 报 道 了 以 稻 田 土 壤 作 为DAMO细菌接种物的研究，并比较了产甲烷污泥、稻田土壤和淡水河沉积物对DAMO细菌富集的不同影响。研究发现，反应器运行500 d后，3种富集物中DAMO细菌的数量分别是接种时的73、646、290倍，这意味着尽管3种接种物都能成功富集获得DAMO细菌，但稻田土壤是最优选择。这是由于稻田土壤的厌氧土层中含有足够多的甲烷〔33〕、丰富的菌群结构和氮肥积累后过剩的含氮物质，这些条件为DAMO微生物的生存提供了理想的生态位。尽管产甲烷污泥在厌氧消化过程中会产生大量甲烷，但其含有的大量有机质使得反硝化细菌比生长缓慢的DAMO细菌具有更强的竞争优势，因此富集培养效果弱于其他2种接种物。然而，楼菊青等〔34〕的研究表明，在相同氮源下，以淡水河沉积物和稻田土壤为混合接种物的反应器，其富集得到的DAMO古菌数量少于淡水河沉积物、污水厂活性污泥及厌氧消化污泥混合接种的反应器。因此，活性污泥和厌氧消化污泥或许在DAMO古菌富集时具有一定的优势。

目前，关于不同接种物对DAMO微生物富集影响机制的研究较为空缺。不同的接种物意味着不同原位环境下的理化性质和菌群结构有所不同。毫无疑问，当原始接种物中DAMO微生物的相对丰度越高，DAMO反应器启动速率将越快，功能微生物的富集数量也会越多。因此，整合分析DAMO接种物来源的特性，并探索适宜DAMO微生物生存的接种源的相关规律，将有助于加快DAMO微生物的富集和应用。

2.2 温度

温度是调控生物生长和繁殖的关键环境因子。实验室首次获得DAMO菌群时的富集温度为25℃〔5〕，K.F.ETTWIG等〔23，25〕将此温度下间歇培养的富集物转移到30℃下进行连续培养后，DAMO古菌在富集物中逐渐消失，只剩下DAMO细菌。然而，温度并不是其中唯一被改变的条件，培养方式和培养基等条件也发生了变化。此后，DAMO细菌的富集温度主要被控制在35℃〔15，28-29〕和30℃〔13，23〕（表1）。Zhanfei HE等研究了不同温度（15～45℃）对DAMO细 菌 的 影 响〔35〕，发 现DAMO细 菌 的 活 性 在35℃下最高，表明DAMO细菌是嗜温性细菌。

在环境温度下富集DAMO微生物可为其在废水处理中的应用提供参考和依据，因此不少研究者评估了环境温度下DAMO微生物的富集过程〔12-13，31-32〕。Tao LIU等〔31〕研究了低温对膜生物膜反应器（MBfR）中DAMO微生物脱氮性能的影响，发现当温度从25℃降至10℃后，DAMO细菌和DAMO古菌的相对丰度依然保持稳定（DAMO细菌：7.9%～10.6%，DAMO古菌：4.5%～7.3%）。低温时，细胞裂解导致碳源增加，有利于DAMO微生物活性和脱氮效率的提高。同时，MBfR作为一种膜曝气与生物膜相结合的水处理技术，其纤维膜表面极易形成生物膜，为DAMO微生物的生长创造了相对稳定的环境。此类研究表明，即使在低温下，DAMO微生物仍然可以维持较稳定的活性，在废水处理中具有广阔的应用前景。

DAMO微生物的共富集研究目前较为缺乏。Shihu HU等〔27〕研 究了 不 同 温 度（22、35、45℃）对DAMO微生物的影响。其中，45℃反应器没有反硝化活性，高温导致了DAMO微生物的细胞组分失活〔35-36〕；22℃富集培养物中只含有DAMO细菌；35℃富集培养物中则同时检测到DAMO古菌和DAMO细菌。因此可以认为，温度较低时，DAMO细菌处于优势，而DAMO古菌则更趋向于在较高温度下生存，对低温较为敏感〔37〕。但这与Tao LIU等〔31〕的研究结果相矛盾，这可能是因为Shihu HU等富集的DAMO古菌主要处于悬浮生长状态，低温下与DAMO细菌竞争时无法形成生物聚集体，从而不利于其生长。

总体而言，DAMO细菌和DAMO古菌都属于嗜温性微生物，但在低温下也可以维持稳定的活性，因此在工程应用方面具有一定的潜力。目前关于环境温度对DAMO微生物的影响机制仍然有待进一步深入探究。

2.3 甲烷传质/分压

甲烷不仅是DAMO反应的电子供体，也是DAMO微生物的唯一碳源〔38〕。因此，甲烷是控制DAMO反应速率的重要变量。单独富集DAMO细菌时，甲 烷 分 压 可 以 低 至10～24 kPa〔32〕；而 共 富 集DAMO细菌和DAMO古菌时，甲烷分压一般在100～300 kPa〔30〕（表1），甲烷分压过低可能会导致DAMO古菌在与DAMO细菌的竞争中失去优势。

甲烷传质阻力对DAMO细菌的影响最先受到研究者们的关注。何崭飞等〔39〕通过建立甲烷的三相传质模型研究了甲烷传质阻力对亚硝酸盐型DAMO反应的影响，并根据模型推导得出DAMO比活性与甲烷传质阻力成反比，降低甲烷传质阻力可以显著提高DAMO比活性。在DAMO反应中，甲烷须经气-液-菌三相传质后才能在微生物细胞内发生反应，三相中气膜的传质阻力可以忽略，细胞膜的传质阻力约为常数，而甲烷不易溶于水的特点使得液膜成为主要的传质阻力。液膜中甲烷的传质与反应器的搅拌速率有关，搅拌速率越大，液相传质阻力越小；但超过一定范围后，增加搅拌速率将不再提高DAMO比活性〔39〕。

随后，研究者们探究了甲烷分压对DAMO细菌和DAMO古菌活性的影响。Chen CAI等〔40-42〕捕捉了甲烷分压调整后DAMO微生物活性的变化过程。在24.3～122.6 kPa范围内，随着甲烷分压的增加，DAMO古菌的硝酸盐还原速率和DAMO细菌的亚硝酸盐还原速率分别增加了58%和303%，说明甲烷分压是其活性增加的驱动因素；而当甲烷分压超过122.6 kPa后，甲烷不再是DAMO微生物活性的限制因素。同时，由于甲烷分压与甲烷溶解度呈线性关系且甲烷溶解度与温度呈线性关系，温度和甲烷溶解度同样会影响DAMO过程〔43〕。此外，通过添加表面活性剂和第二液相等方法也可以提高甲烷的液相溶解度系数〔39〕。

综上，通过一些方法可以在一定范围内提高DAMO微生物的甲烷利用效率。然而，甲烷分压对DAMO细菌和DAMO古菌之间相互竞争关系的影响还未得到深入研究。

2.4 反应器构型

反应器构型对气液传质速率和传质方式、微生物聚集物的颗粒大小和形态有着显著影响。序批式反应器（SBR）、序半连续式反应器（SFBR）和连续搅拌罐反应器（CSTR）适合培养生长缓慢的微生物，是使用最早且最多的富集DAMO微生物的反应器〔44〕。然而，SFBR在富集DAMO微生物时容易出现亚硝酸盐积累〔15〕，CSTR可以很好地控制底物（亚硝酸盐）负荷，但微生物截留效率和气相传质效率均较低。

随后，Ying SHI等〔45〕尝试使用中空纤维膜生物反应器（HfMBR）实现DAMO微生物和Anammox细菌的共富集，其反硝化速率最高为190 mg/（L·d）（以N计），远高于已报道的其他DAMO的反硝化速率。在HfMBR中，微生物附着在纤维表面形成生物膜，甲烷通过中空纤维膜直接转移至DAMO微生物，传质过程缩短，提高了DAMO反应中的甲烷利用率〔46〕。

然而，HfMBR也有缺点，如较长的启动时间〔47〕、高比表面积膜（可达2 222 m2/m3〔45〕）带来的高成本、富集物转培后脱氮性能迅速下降〔46〕等。因此，Wenbo NIE等〔28〕开发 了 一种 基 于MBR改 良 的 新 型反应器——膜曝气膜生物反应器（MAMBR），该反应器采用膜曝气技术，不仅有透气性隔水致密膜进行高效甲烷输送，同时有超滤膜保持生物量浓度。MAMBR首次实现了7个月快速富集获得高浓度DAMO菌群，其中DAMO古菌的相对丰度高达40.87%。而且，MAMBR的比表面积（20 m2/m3）仅为HfMBR的0.9%～4.1%，富集物接种方便，是目前应用比较理想的反应器。

随着科研工作者的不断研究和创新，各种反应器构型也在不断被优化，微生物燃料电池（MFC）与各类型反应器的耦合或许也是快速富集DAMO微生物、实现高效脱氮的一个新方向〔48〕。

3 DAMO微生物的潜在应用

传统的生物脱氮技术主要通过硝化/反硝化过程去除废水中的氮化合物。然而，反硝化过程会产生温室气体N2O，同时反硝化菌需要利用有机碳源作为电子供体。当废水中碳源有机物含量不足时就需要额外添加碳源（醇类、有机酸类），水处理成本增加，残余碳源还存在二次污染的风险。而废水经过厌氧处理后，出水中的溶解性甲烷可达到系统中甲烷总产生量的40%及以上〔49〕，同时污泥消化过程也会产生甲烷，二者均可作为DAMO反硝化的电子供体。因此，DAMO过程相较传统脱氮过程可以节约大量能源和成本，并可解决碳源短缺和温室气体排放的问题，具有一定的应用前景。

DAMO过程可与SHARON工艺联用来处理C/N较低的废水。SHARON工艺由于需要驯化氨氧化菌将氨氮硝化控制在亚硝酸盐阶段，对环境条件的要求比较严格。而联合工艺可放宽pH、温度等条件范围，即使硝化过程出现硝酸盐，DAMO古菌也可将其转化为亚硝酸盐，而后再被DAMO细菌进一步转化为N2。通常情况下，短程硝化反硝化由于难以维持稳定的亚硝酸盐状态，成功实例并不多，而DAMO-SHARON联合工艺则具有明显的应用优势。

此外，DAMO过程与Anammox联用也具有较好的应用前景。Anammox是区别于传统反硝化的另一种脱氮途径，其是在缺氧条件下，以氨为电子供体、亚硝酸盐为电子受体，生成N2和少量硝酸盐的过程。Anammox作为一种节能高效的废水处理方式，已被广泛研究并工程化应用〔50〕。Anammox菌对pH、溶解氧、温度等环境因子的要求几乎与DAMO微生物一致，因此很多研究者采集的环境样品中同时含有Anammox和DAMO微生物，将二者进行共富集后可同时去除CH4、NO2-、NO3-和NH4+。进水中的NH4+和部分NO2-被Anammox菌转化为N2和少量NO3-；生成的NO3-和进水中的NO3-被DAMO古菌转化为NO2-，进而被DAMO细菌最终转化为N2。这种组合的脱氮方式具有低碳节能的优势且具有可行性，相比单一的Anammox工艺更加灵活，对进水氮负荷波动的耐受性更强，可去除过量的铵盐、硝酸盐和亚硝酸盐。另外，Zhaowei DING等〔29〕的研究发现，Anammox菌不仅可与DAMO微生物共存，甚至可以提高DAMO古菌的活性，这是由于Anammox菌与DAMO细菌同时消耗NO2-，使NO2-浓度维持在较低水平，有利于DAMO古菌更快地催化NO3-还 原。Baoli ZHU等〔50〕在2011年首次实现了DAMO与Anammox微生物的共富集，此后陆续有研究者成功富集并获得混合菌群。但即使接种物是富集菌群，反应器的启动时间也几乎都在半年以上，脱氮效率也低于传统脱氮工艺，因此需要提高功能菌群的富集速度和脱氮效率以促进联合工艺投入实际工程应用。

4 未来研究方向

4.1 DAMO古菌对碳氮循环的贡献

研究者们针对DAMO细菌在自然环境中的贡献及其在反应器中的过程机理开展了广泛研究，然而针对DAMO古菌的研究则较为匮乏。实际上，由于DAMO细菌仅能以NO2-为电子受体催化甲烷氧化，而自然环境中的氮污染物则更多以NO3-的形式存在。因此，DAMO古菌对系统内甲烷消耗和氮去除的贡献也相当重要。目前，研究者们仅在安徽稻田、巢湖、长江口等地开展过DAMO古菌的环境调研工作，并未获得系统的DAMO古菌环境分布信息，且未评估过硝酸盐型DAMO过程对环境中碳氮循环的贡献。因此，需要对DAMO古菌开展更多的研究工作，并计算硝酸盐型DAMO反应中的氮气产生通量和甲烷氧化量，从而科学地评价其环境功能意义。

4.2 模型研究

数学模型早已被广泛应用于模拟和预测废水处理过程中的各项指标，但较少有研究者致力于构建DAMO过程的数学模型。建模需要有充分的实验数据，才能准确描述反应器中各物种之间的化学计量关系和动力学参数。DAMO模型可由多个方程描述，如用Michaelis-Menten方程描述酶促反应动力学，用Monod方程描述甲烷浓度与反硝化速率之间的 关系。Xueming CHEN等〔51〕利 用AQUASIM软 件构建了生物膜多基质模型以预测反应器中的甲烷氧化量和氮转化量，H.S.LEE等〔52〕则建模探讨了反硝化动力学参数对DAMO反应的影响。然而，目前的DAMO模型都是基于膜生物膜反应器（MBfR）开发的，未来研究者们可根据采用的反应器类型构建新的适用模型，并据此优化反应器构型和反应条件。

5 结语

DAMO微生物近年来被证实存在于各种自然环境中，其富集过程、催化功能和影响因素是目前的研究热点。但关于影响因素的研究大多较为局限，且很少对机理进行深入探讨。值得注意的是，探索不同影响因子下DAMO微生物的响应机制能够为其高效富集提供有力依据。同时，DAMO微生物作为自然环境中甲烷和氮素的有效转化系统，其对全球甲烷转化的贡献量至今尚未被系统准确评估。总之，目前此领域仍存在较多未知问题，亟待更多元、更深入的探索研究。