前列腺癌恩杂鲁胺耐药基因的生物信息分析

杨小兵，魏德超，冯 涛，赵佳晖，王永兴，韩毅力，罗 勇，姜永光

(首都医科大学附属北京安贞医院泌尿外科，北京 100029)

去势抵抗型前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)是前列腺癌(prostate cancer，PCa)恶性进展的极晚期状态，对传统雄激素剥夺治疗抵抗，预后极差。一直以来，除了多西他赛化疗勉强使CRPC患者生存获益18.9个月外[1]，并无其他更为有效的治疗选择。以恩杂鲁胺(enzalutamide，ENZ)为代表的第二代雄激素受体(androgen receptor，AR)抑制剂的问世，革新了CRPC 新型内分泌治疗理念、大幅延长了CRPC患者的中位生存时间[2]，堪称近年来CRPC 阶段最重要的治疗突破。尽管如此，那些初始治疗有效的患者在经过大约11.2 个月的缓解期后仍会出现ENZ耐药的问题[2]。届时，ENZ耐药的CRPC患者将面临治无可药的困境。因此，如何克服ENZ耐药一直是CRPC领域非常重要的研究焦点。在本研究中，我们从GEO数据库中下载了ENZ耐药的PCa细胞株的数据集(GSE104935),利用生物信息分析的方法筛选差异表达基因(differential expression genes，DEGs)，进行GO/KEGG富集分析，构建PPI网络筛选中枢潜在耐药基因，为临床解决ENZ耐药问题寻找新的作用靶点。

1 资料与方法

1.1 基因表达数据集的收集ENZ耐药的数据集(GSE104935)来源于美国国立生物技术信息中心NCBI的基因表达数据库(Gene Expression Omnibus data base，GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，该数据集包含了10组样本的测序数据，其中4组为C4-2B细胞株(2组ENZ处理耐药：C4-2B-ENZ；2组DMSO处理对照：C2-4B)，另外6组为LNCaP细胞株(3组ENZ处理耐药：LNCaP-ENZ，3组DMSO处理对照：LNCaP)。

1.2 差异表达基因的筛选使用R语言(版本：4.1.2)的limma软件包分别研究4组C4-2B细胞株和6组LNCaP细胞株基因的差异表达，“P<0.05且log2FC(倍数变化)> 1或log2FC(倍数变化)<-1”被定义为基因差异表达的筛选阈值。使用R语言的ggplot2和ggreple软件包绘制火山图对差异基因分析结果进行可视化。为进一步筛选在不同前列腺癌耐药株中均发挥共同作用的DEGs，使用Bioinformatics的在线绘图工具Venn Diagrams(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制韦恩图，得到两种不同耐药细胞株共表达的上下调基因。

1.3 差异表达基因的富集分析为了进一步确认DEGs的潜在功能，利用DAVID网站(https://david-d.ncifcrf.gov/tools.jsp)对上调基因和下调基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析用于注释具有功能的差异基因，主要包括分子功能(molecular founction，MF)、生物过程(biological process，BP)和细胞组分(cellular component，CC)3方面的内容。KEGG通路富集分析用于识别差异基因发挥作用的信号通路。使用在线绘图工具Bioinformatics(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制多分类气泡图对GO/KEGG富集结果进行可视化。

1.4 PPI网络构建与核心基因筛选为了进一步了解DEGs之间的相互作用关系，筛选在其中起到关键作用的Hub基因，利用STRING数据库(https://string-db.org)构建蛋白质互作网络(protein-protein interaction network，PPI network)，使用Cytoscope软件(版本：3.8.2)对上述PPI网络进行优化，并利用其cytoHubba软件包中的MCC方法对DEGs进行排序和评估，最终生成前10位Hub基因的蛋白质网络。最后，使用R语言的heatmap软件包绘制基因热图对Hub基因差异表达的定量数据进行可视化。

1.5 Hub基因的富集分析为了更好地说明Hub基因的潜在功能，首先利用Cytoscope软件的ClueGO软件包对Hub基因及其相邻基因进行GO/KEGG富集分析，再利用yFiles Layout Algorithms软件包对富集结果进行可视化。为了进一步了解上述基因的生物途径，利用Bioinformatics进行富集，并用弦图、条形图和气泡图对结果进行可视化。

1.6 生存分析为了解ENZ耐药后异常表达的Hub基因是否与PCa患者的生存预后相关，利用GEPIA数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn/#survival)对Hub基因进行生存分析，绘制无进展生存期(progression-free survival，PFS)曲线。

2 结 果

2.1 ENZ耐药细胞株DEGs筛选及功能富集分析C4-2B-ENZ与C4-2B相比，包含了448个上调基因和447个下调基因(图1A和C)。LNCaP-ENZ与LNCaP相比，包含了561个上调基因和482下调基因(图1B和C)。其中，C4-2B-ENZ与LNCaP-ENZ共表达的上调基因为106个，下调基因为88个(图1C)。GO富集分析表明耐药株共表达的上调基因调节的生物过程主要集中在男性性腺的发育、前列腺上皮组织生发、转录翻译的调节、泛素化蛋白的降解，调节的细胞组分主要富集在核及胞外内体、染色质、细胞膜及细胞质，调节的分子功能主要富集在DNA、蛋白质及PDZ结构域的结合(图1D)。KEGG富集分析表明共表达的上调基因主要在微量元素吸收、胆汁分泌及化学致癌相关受体激活这些通路富集(图1D)。然而，GO富集分析显示耐药株共表达的下调基因调节的生物过程主要集中在DNA转录的调节及蛋白质泛素化，调节的细胞组分主要富集在细胞膜、内质网膜、细胞质及核质，调节的分子功能主要富集在蛋白激酶及磷脂的结合(图1E)。KEGG富集分析显示共表达的下调基因主要在癌症的表达失调、前列腺癌相关的通路富集(图1E)。

2.2 共表达差异基因的PPI网络构建及Hub基因筛选PPI网络分析表明在C4-2B-ENZ与LNCaP-ENZ共表达的194个基因中，共计有99个基因的相互作用关系密切(图2A)。利用cytoHubba软件包中的MCC方法对上述基因进行排序和评估，最终生成在该网络中起到核心作用的前10 个Hub基因(上调：ACPP、AR和LEF1，下调：KLK2、TMPRSS2、ZBTB16、FOXO1、NKX3-1、PMEPA1和SLC45A3，图2C、E)及与其相邻的13个基因(上调：VAV3、HEY1、HOXA10、DLX3、ATP2B1、ZFHX4、WLS、GPER1、SVIL、MSX2及PATZ1，下调：NFIB、GNMT及NKX3-1，图2B、D)。

2.3 Hub基因及其相邻基因的富集分析ClueGO软件包对Hub基因及其相邻基因的GO/KEGG富集分析结果表明Hub基因中除ACPP外，AR、LEF1、KLK2、TMPRSS2、ZBTB16、FOXO1、NKX3-1、PMEPA1和SLC45A3的异常表达均与前列腺癌的发生发展密切相关，其中AR、LEF1、FOXO1、NKX3-1和PMEPA1在类固醇激素刺激的细胞反应及其调节的信号通路富集，TMPRSS2、ZBTB16 SLC45A3在癌症表达失调的相关通路富集(图3A、B)，上述基因在调节类固醇激素刺激的细胞反应的生物过程中富集尤为明显(图3C、D)。

2.4 Hub基因异常表达对PCa患者生存预后的影响利用GEPIA数据库对Hub基因进行生存分析，结果表明Hub基因中AR、FOXO1、NKX3-1和SLC45A3与PCa患者生存预后密切相关，AR高表达组患者的生存预后较低表达组差(图4A)，而FOXO1、NKX3-1和SLC45A3高表达组的生存预后明显优于低表达组(图4B～D)。这些结果提示我们上述基因的异常表达可能是CRPC恶性进展、ENZ治疗失败的原因之一。

3 讨 论

以ENZ为代表的新型内分泌药物耐药一直是严重影响晚期CRPC患者生存预后的重要因素，也是干扰泌尿外科医生临床决策的极大难题。尽管现阶段的研究已表明AR再激活、突变及剪切变异体诱导其下游信号通路的恢复是晚期CRPC患者ENZ耐药的重要机制之一[3]，但是具体调控细节仍存在诸多亟待深入研究的地方。因此，我们利用生物信息学的分析方法，就ENZ耐药的两种不同细胞株的测序数据进行深入挖掘，共计筛选了194个DEGss，并对其功能进行识别，发现上述基因主要与DNA的转录翻译、信号通路的调节及肿瘤的发生发展相关。

为了寻找其中潜在的耐药基因，我们进一步构建了上述基因的表达网络，最终筛选出10个起到关键作用的Hub基因。通过对其功能的富集分析，发现其与激素调节的相关信号通路及前列腺癌的发生发展关系密切。在这10个Hub基因中，又以AR、FOXO1、NKX3-1和SLC45A3与PCa患者的生存预后关系最为密切。其中，AR属于类固醇激素受体家族，起转录因子的作用，主要是调节编码前列腺功能所需蛋白质转录的基因，促进正常前列腺的细胞分化[4]。最近的研究表明，尽管接受了ENZ治疗，但是AR在CRPC中仍然高度表达并具有转录活性[5]。因此，靶向AR的增强子可能成为治疗CRPC患者ENZ耐药的潜在方法。

FOXO1属于叉头盒转录因子O(forkhead box O，FOXO)家族，通过调节促凋亡基因、细胞周期相关基因及DNA损伤反应基因的表达发挥抑癌功能[6]。研究显示FOXO1的激活能够抑制PCa细胞的增殖和侵袭能力，诱导其凋亡[7-9]。更为重要的是，FOXO1在PCa中不但能够抑制全长AR的活性，对AR的剪切变异体，如AR-V7的转录活性也具有良好的抑制作用[10]。然而，作为PTEN抑癌基因的下游效应子，FOXO1表达下调在PTEN 缺失或突变的晚期/转移性前列腺癌中却非常常见[9-11]。此外，YANG等[12]发现与低表达患者相比，FOXO1高表达的PCa患者发生生化复发的可能性更小。TANG等[8]的生存分析也证实了FOXO1高表达的PCa患者的无进展生存率(progression-free survival,PFS)明显好于低表达患者，与我们的分析结果相符。这些结果表明FOXO1活性的抑制对于PCa细胞的存活极为重要，因此诸如紫杉醇类能够增加FOXO1表达量的化疗药联合ENZ用药，不失为增强ENZ疗效、延缓其耐药发生的合理治疗策略。

NKX3-1作为前列腺特异性同源盒基因，主要起转录因子的作用，可调节前列腺分化并抑制前列腺癌的发生[13]。研究发现NKX3-1基因拷贝丢失在CRPC中比在局限性疾病中更频繁，其表达缺失或下调能够激活AR及AR-V7信号通路、促使CRPC恶性进展[14-15]。PAPACHRISTODOULOU等[16]的生存分析结果显示NKX3-1表达下调与疾病的不良预后密切相关，如更快的生化复发及更短的中位生存时间，这也与我们的分析结果相似。因此，靶向NKX3-1的上游调节基因如AURKA[14]、LIMK2[15]等，抑制其蛋白降解，似乎也是一种合理的抑制CRPC恶性进展、改善ENZ疗效的治疗措施。

SLC45A3属于溶质载体家族，也被称为Prostein/P501S，是一种前列腺特异性的雄激素调节基因，常与红细胞转化特异性(erythroblast transformation specific，ETS)家族成员基因(如ETV1、ETV5、ERG及ELK4等)融合。尽管目前具体生物学功能尚不明确，但其对PCa而言在诊断及预后方面均有重要意义[17-18]。研究表明与原发性PCa相比，转移性PCa中SLC45A3 蛋白表达较低，并且SLC45A3低表达的患者生化复发时间显著缩短[19-20]，与我们的分析结果相似。虽然SLC45A3的功能定位决定了其在诱导ENZ耐药的关键环节可能并未发挥作用，但是其在ENZ耐药株中低表达，这似乎预示着其可以作为一个细胞耐药的标志物。因此，对于那些SLC45A3低表达的CRPC患者，我们能够制定更为精准的治疗策略，最大程度上改善患者的生存预后。

总之，由于本文仅通过单一数据集筛选差异基因，为了尽可能多地获得DEGs，我们放宽了筛选标准，增加了DEGs的假阳性率。尽管最终分析得到的4个Hub基因，尤其是FOXO1和NKX3-1与CRPC的恶性进展密切相关，可能成为改善ENZ疗效、延长CRPC患者生存时间的潜在治疗靶点，但仍需结合临床标本，通过基因芯片等在后续试验中进一步验证。