小鼠隐睾组织病理变化与血清抑制素B和抗苗勒管激素水平的相关性

周 玲，亚森江·阿布都拉，和 军，颜景灏，李水学

(新疆维吾尔自治区人民医院小儿外科，新疆乌鲁木齐 830001)

隐睾症(cryptorchidism)是男性最常见的泌尿生殖系统异常，是由于单侧或双侧睾丸下降过程障碍导致睾丸组织停留于阴囊以上的位置所导致，足月儿发生率2%～4%[1]。这一发病率在早产儿中更高，尤其合并低体重的患儿[2]。隐睾症的发生机制尚不完全明确，不同的因素导致睾丸下降受阻，从而不同程度地影响患侧睾丸的发育和远期生育能力。抑制素B(inhibin-B，INH-B)与抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)均由睾丸支持细胞产生，其水平与睾丸支持细胞的数量及功能有关[3-4]。本实验通过建立小鼠隐睾模型，研究其睾丸质量及睾丸组织病理学变化，检测小鼠血清INH-B、AMH水平，探索两种激素变化与隐睾睾丸损伤之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 实验动物正常生长的50只健康美国癌症研究所(Institate of Cancer Research,ICR)雄性小鼠(20日龄)，体质量25～39 g，利用随机数字表将小鼠随机分为3组：即假手术组15只、单侧隐睾组15只、双侧隐睾组20只。

1.2 主要仪器与试剂0．3%(体积分数)戊巴比妥钠、整套手术器械、BS-1105型电子天平(北京赛多科斯天平有限公司)、甲醛、生理盐水、甲硝唑、不同体积分数(100%、95%、75%)乙醇溶液。

1.3 实验方法

1.3.1建立隐睾模型 所有小鼠进行称重、标号，随机分为假手术组(15只)、单侧隐睾组(15只)及双侧隐睾组(20只)3组。选取单侧组小鼠和双侧组小鼠，每只小鼠用体积分数0.3%苯巴比妥(35 mg/kg 腹腔内注射)麻醉，腹部备皮消毒后单侧组在左下腹取1.5 cm手术切口、双侧组在下腹正中取2 cm小切口；打开腹腔，轻轻拖出睾丸(单侧组取左侧睾丸、双侧组取双侧睾丸)，牵拉至腹腔，剪切引带，缝合固定于腹腔内，单侧组右侧睾丸不做任何处理，缝合腹部切口关腹(1只双侧组小鼠术中死亡)。假手术组小鼠取左下腹切口，打开腹腔牵拉双侧睾丸组织，但不剪切引带，也不固定，保持双侧睾丸原位，即假手术组。术后第1、3、5天所有小鼠腹腔注射甲硝唑预防感染。所有小鼠在同样环境下饲养，即：12/12 h昼夜交替饲养，环境温度(22±1)℃，湿度为(50±3)%，固定时间给予食物、饮用水。

1.3.2取出标本 分别在造模后第10、20、30天取假手术组小鼠5只、单侧组小鼠5只、双侧组小鼠6只(第30天双侧组小鼠7只)，测量记录每只小鼠体重。用体积分数0.3%苯巴比妥(35 mg/kg 腹腔内注射)麻醉，用正中切口进入腹腔，分离腹主动脉采血约10 mL/只，离心(3 000 r/s 5 min)取上清液保存在-80 ℃冰箱内。取双侧睾丸组织清洗后称重，测量左右、前后及上下经，用体积分数10%甲醛溶液浸泡保存。

1.3.3测量血清INH-B和AMH水平 实验中取出血清用小鼠专用ELISA试剂盒酶联免疫法测量相应指标，定量结果选择对数-对数立方回归分析模型。

1.3.4睾丸组织病理学检查睾丸组织 用常规石蜡包埋，切片及HE染色，光学显微镜下观察依据Johnsen评分标准(表1)进行评分。

表1 Johnsen评分标准

2 结 果

2.1 实验小鼠体质量及睾丸相关参数实验小鼠体质量：在不同时间段(术前及术后10、20、30 d)测量3组小鼠体质量进行比较，各组之间差异均无统计学意义(P<0.05, 表2)。睾丸质量：单侧组小鼠健侧睾丸质量与患侧睾丸质量比较、双侧组平均睾丸质量与假手术组平均睾丸质量比较，差异均有统计学意义(P<0.05，表3)。睾丸体积：单侧组健侧睾丸体积与患侧睾丸体积比较、双侧组平均睾丸体积与假手术组平均睾丸体积比较，差异均有统计学意义(P<0.05，表3)。

表2 各个时间段3组小鼠体质量比较

表3 各组小鼠睾丸质量、体积、Johnsen评分比较

2.2 实验小鼠睾丸组织病理变化3组睾丸组织HE染色发现，单侧组患侧睾丸和双侧组睾丸组织均可见生精细胞凋亡。单侧组患侧睾丸精子数量明显少于自身对照健侧睾丸组织，这一差距在取材时间与造模时间之间间隔较长的小鼠中更明显，直至有些患侧睾丸生精小管仅可见少数精母细胞。双侧隐睾组的睾丸组织与单侧组患侧睾丸病理变化大致相似。而假手术组隐睾标本发育可，可见成熟生精细胞、精子发生过程，生精小管可见多个精子细胞。

Johnsen评分发现，单侧组患侧睾丸的评分明显低于其自身健侧，双侧组评分明显低于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.05，表3)。

2.3 各组小鼠血清AMH 、INH-B水平比较所取得血清标本用ELISA酶联免疫法测量血清AMH和INH-B水平。单侧组、双侧组和假手术组血清AMH、INH-B水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05，表4)，其中假手术组血清两种激素水平最高、双侧组最低。

表4 各组小鼠血清AMH、INH-B水平比较

3 讨 论

1932年，MCCULLAGH 首次从睾丸组织提取某种可抑制腺垂体活动的物质且命名为“抑制素”。抑制素属于转化生长因子超家族，其中目前研究较多的INH-B是由α、β两种亚基组成[6]。而AMH为二聚体糖蛋白，其生理功能是抑制雄性苗勒管的发育，参与睾丸的分化和发育[7]。以上两种激素青春期前均由睾丸支持细胞分泌产生[3-4]。青春期前睾丸生精活动处于静止状态，与成人不同，所以在成人睾丸相关的重要指标，如睾酮、促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone, LH)等在儿童时期无法评估睾丸功能，因为在青春期前性腺发育过程中起到主要作用的是睾丸支持细胞而不是睾丸间质细胞。青春期前血清INH-B和AMH 水平可间接评估睾丸支持细胞的功能即青春期前的睾丸功能[3-4]。但是儿童血清INH-B和AMH水平受不同因素影响，在儿童不同时期水平均不相同，尤其是AMH水平[8]。所以隐睾症与两种激素水平的研究中动物实验更有可信性。

本研究中3组小鼠体质量在各时期变化无差异，说明在同样环境中增长无差异性。而睾丸质量及睾丸体积等参数中单侧组小鼠患侧明显小于健侧，说明在造模成功、造模后患侧睾丸因较高温度环境的影响发育比健侧睾丸明显下降，这一差距同样在双侧组和假手术组的睾丸平均参数中也可得到。形态学上表现的睾丸萎缩，病理学上是睾丸生殖细胞的凋亡所导致，这一病理改变可直接影响生育功能[9]。为了更好地确定这一病理改变，我们在处死小鼠后取出双侧睾丸组织进行病理评分(johnsen评分)，结果显示单侧组患侧睾丸的评分明显低于其自身对照侧，双侧组明显低于假手术组：说明在单侧组患侧睾丸及双侧组双侧睾丸组织不仅是体积和质量上与正常发育的睾丸有差异，在病理改变上也有明显的差异性，这一差异在取材时间与造模时间之间间隔越长的小鼠中越明显，睾丸质量和体积的差异性也如此。这一规律在临床上也被完全公认，隐睾病史越长的患儿患侧睾丸组织萎缩程度越高。WANG等[10]的研究也得出了同样的结果。

我们在实验小鼠处死时从腹主动脉取出血液标本进行INH-B和AMH激素水平的检测，3组小鼠两种激素水平数据对比后发现双侧组两种激素水平最低，假手术组水平最高。这一差异性跟睾丸参数及病理评分完全符合，即睾丸组织受损最严重的(睾丸体积和质量最低，病理评分最低)双侧组血清两种激素水平最低，而睾丸组织发育没有受损的假手术组血清两种激素水平最高，这一差距在隐睾患儿的研究中已被证实[11-12]。不管是小鼠还是人类患儿，单侧隐睾病例两种激素水平高于双侧隐睾者，这可能与单侧隐睾组健侧睾丸的代偿作用有关，但仍达不到正常水平。INH-B和AMH两种激素均由睾丸支持细胞分泌产生[3-4]，而在本研究中取出睾丸组织病理检查发现双侧组中睾丸组织评分非常低，严重影响了睾丸的正常发育，单侧组次之，假手术组几乎是正常发育状态，这可以对应3组血清激素水平的差异性。我们可以得出血清INH-B和AMH激素水平可以间接地标志着睾丸的发育状态，可以评估青春期前隐睾患儿的睾丸功能。

综上所述，血清INH-B和AMH是一种简便、准确的血清标志物，可以很好地评估隐睾睾丸组织的功能。虽然睾丸组织的病理检查是最准确的评估方式，但是隐睾症患儿无法常规行睾丸组织活检，所以需要创伤性小的检测方式来替代睾丸组织活检。不幸的是，由于儿童从生长发育各阶段INH-B和AMH水平受到很多因素的影响而不同[13]、无法确定其在某一个时期的正常或异常值范围。因此可能需要更多的血清学、影像学检查来辅助评估儿童睾丸功能。隐睾患儿睾丸功能血清标志物需要进一步研究并提供准确的激素水平参考范围，才能改善隐睾症患儿生育功能等远期预后。