呼吸道病原菌在细菌培养阳性组和阴性组中多重定量PCR检测结果的对比分析

卓献霞 赵建康 曹 彬*

(1.首都医科大学中日友好临床医学院，北京 100029；2. 中日友好医院呼吸与危重症医学科，北京 100029)

下呼吸道感染主要是指发生于气管、支气管和肺部的感染[1-2]。引起下呼吸道感染的病因较多，其中细菌感染约占全部病因的10% ～ 60%[3-5]。痰和支气管肺泡灌洗液是用于检测下呼吸道感染的最常用标本，采用传统培养法检测细菌病原体不仅灵敏度较低、耗时较长，且无法对病原体进行准确定量。而分子诊断方法不仅快速、灵敏[6-7]，并且能对部分病原体进行准确定量[8-10]。本研究采用的多重定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种新开发的针对常见下呼吸道细菌感染诊断的方法，目的是评估该方法在下呼吸道标本细菌定量方面的性能。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2019年11月至2021年3月在中日友好医院临床微生物与感染实验室125例下呼吸道感染患者的痰液或支气管肺泡灌洗液，同时采用传统培养方法和多重定量PCR方法检测病原体，将其中多重定量PCR阳性的101例患者作为研究对象。病例排除标准：①多重定量PCR阴性；②年龄<18岁；③活动性肺结核患者；④囊性纤维化患者；⑤痰质量不合格(痰涂片革兰染色镜检提示白细胞<25个/低倍视野及扁平上皮细胞>10个/低倍视野)。本研究已获得本院伦理委员会批准(伦理审批号：2019-170-K116-2)，所有研究对象或其家属均已签署知情同意书。

1.2 资料收集

收集入组患者的基本信息(姓名、性别、年龄、有无发热、咳嗽、咳痰、胸痛、呼吸困难、咯血、肺部影像学异常、机械通气、住院死亡)同时记录患者的诊断类型。

1.3 样本处理和分组

对从125例患者中收集的痰或支气管肺泡灌洗液样本进行传统培养和多重定量PCR(北京卓诚惠生生物公司提供)检测，把多重定量PCR阳性病例分为培养阳性组和培养阴性组，同时比较各种细菌在培养阳性组和培养阴性组细菌定量的差异。应用多重定量PCR检测如下目标病原菌：鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪肠球菌(Enterococcusfaecium)、屎肠球菌(Enterococcusfaecalis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组患者的基本信息比较

所有样本在采样前均已暴露于抗菌药物，在多重定量PCR阳性病例中，细菌培养阳性31例，细菌培养阴性70例，其中社区获得性肺炎44例、医院获得性肺炎18例、慢性阻塞性肺疾病急性加重21例和支气管扩张合并感染18例。与细菌培养阴性组比较，细菌培养阳性组的住院病死率更高(P<0.05)。在医院获得性肺炎患者中细菌培养阳性比细菌培养阴性更常见，且两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 101例多重定量PCR阳性患者的基本信息

2.2 多重定量PCR方法在细菌培养阳性组和阴性组检出病原体次数比较

在101例多重定量PCR阳性样本中，多重定量PCR在培养阳性组共检出目标病原菌阳性33次，在培养阴性组共检出目标病原菌阳性144次。在培养阳性组和阴性组均以铜绿假单胞菌检出率最高，但培养阳性组的检出率高于阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)；另外阴性组的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌的检出率均高于阳性组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 多重定量PCR方法在细菌培养阳性组和培养阴性组检出病原体次数比较

2.3 细菌培养阳性组和阴性组细菌定量中位数比较

在多重定量PCR阳性标本中，比较细菌在培养阳性组和培养阴性组中的定量结果，发现铜绿假单胞菌在培养阳性组的细菌定量中位值大于细菌培养阴性组(1.44×108copies/mLvs1.22×107copies/mL)。鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌也得到类似的结果，在培养阳性组和阴性组的定量中位值分别是7.10×108copies/mLvs4.83×106copies/mL(鲍曼不动杆菌)和4.28×107copies/mLvs5.77×104copies/mL(肺炎克雷伯菌)，组间比较差异有统计学意义(P< 0.05)，详见图1。其余9种目标病原菌因无培养阳性或培养阳性病例太少而无法进行培养阳性组和阴性组细菌定量的比较。

图1 比较细菌病原体在培养阳性组和阴性组的中位细菌定量值

3 讨论

与传统培养方法比较，分子诊断技术具有快速、灵敏、特异等优势[11]，且部分分子诊断方法能对病原体进行准确定量。本研究在101例多重定量PCR阳性样本中，使用多重定量PCR分子诊断方法在细菌培养阳性组检出目标病原体33次，在细菌培养阴性组检出目标病原体144次，且多重定量PCR检测细菌病原体定量中位值在细菌培养阳性组明显高于细菌培养阴性组。此外，多重定量PCR方法获取病原学结果仅需要3～6 h，耗时远远短于传统的培养方法。

本研究中，多重定量PCR在培养阳性组的铜绿假单胞菌检出率高于在培养阴性组的检出率，且差异具有统计学意义，这可能与传统培养法和分子诊断法检测铜绿假单胞菌敏感性较好有关[12-13]，且铜绿假单胞菌多发生于医院内感染，对一般的广谱抗菌药物不敏感，如医院获得性肺炎。虽然本研究中所有样本均暴露于抗菌药物，但它对培养法检出铜绿假单胞菌影响不大，这可能是培养阳性组检出率高于阴性组的原因之一。此外，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌在培养阴性组的病原体检出率高于阳性组，有研究[14]显示， 肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等细菌对抗菌药物较敏感，而本研究纳入所有样本均已暴露于抗菌药物，因而这些对抗菌药物较敏感的细菌在暴露于抗菌药物后已死亡，导致培养阴性，而多重定量PCR检测的是样本的核酸，不管是否已暴露于抗菌药物，其敏感性不受影响，这可能是培养阴性组病原体检出率高于阳性组的原因之一。

在对细菌定性检测的同时，越来越多的研究开始关注细菌的定量。一项研究[15]纳入了84例诊断为肺炎的患者并采集了84份支气管肺泡灌洗液标本，同时采用传统培养和Unyvero肺炎系统进行检测，结果显示Unyvero分子诊断方法在细菌培养阳性组的信号强度高于培养阴性组，这一结果与本研究的细菌定量中位值在培养阳性组高于培养阴性组的结果是一致的。

本研究也存在一些局限性。首先，本研究是单中心前瞻性研究，仅纳入了101例样本进行分析，样本量相对较少，研究结果可能代表性不强，今后还需要进一步扩大样本量及多中心收集临床样本进一步分析。其次，本研究收集的样本均已暴露于抗菌药物，一些对抗菌药物较敏感的细菌在培养时出现假阴性结果，这可能是培养阳性率较低的原因之一。因此，在以后类似的研究中可以考虑收集未暴露于抗菌药物的呼吸道样本进行对照分析。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明卓献霞、赵建康：提出研究思路，设计研究方案，采集、分析数据，撰写论文；曹彬：总体把关，审定论文。