保肾通络方含药血清调节线粒体自噬对高糖诱导下足细胞氧化损伤的影响

王梦迪 郭弋凡，2 庞彦余 刘羽飞,2 赵文景*

(1.首都医科大学附属北京中医医院肾病科，北京 100010；2.北京中医药大学，北京 100029)

糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病最严重的微血管并发症之一，也是导致终末期肾脏病(end stage renal disease, ESRD)的重要病因[1]。如何有效延缓DKD进展是目前中西医治疗的瓶颈。蛋白尿是DKD的重要临床特征之一，也是DKD患者肾功能进展的独立危险因素，DKD患者一旦出现临床水平蛋白尿，肾功能损伤将持续进展，进入ESRD的速度可达其他肾脏病变的14倍[2]。足细胞作为肾小球滤过屏障的重要组成部分，其损伤与蛋白尿的发生和DKD进展密切相关[3]。氧化应激在DKD发生和进展中的作用已被研究[4]证实，在糖尿病或高血糖状态下，以活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)为主的活性分子生成增多，抗氧化物质减少，过量ROS在细胞内积聚，从而导致氧化应激。氧化应激可以通过多种途径及信号通路损伤足细胞，引起足细胞凋亡、脱落等各种病理改变[5]。然而临床研究[6]显示，单纯抗氧化治疗在延缓DKD进展中的疗效却差强人意，因此有必要对足细胞氧化损伤机制进行深入研究。线粒体作为细胞ROS的主要来源，近年来在DKD发病中的作用引起了广泛关注，其在足细胞氧化损伤中的作用值得进一步探讨。本课题组前期临床研究[7-8]表明，保肾通络方能够有效减少DKD患者尿蛋白、改善肾功能，在实验研究[9]中也证实，保肾通络方能够有效减少糖尿病小鼠及高糖培养的足细胞损伤。本研究旨在观察保肾通络方含药血清对高糖培养下足细胞氧化损伤的影响，并探讨其对足细胞的保护作用与改善线粒体自噬的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

永生化小鼠足细胞株MPC5，由首都医科大学附属北京中医医院刘宝利教授赠送，细胞来源于美国迈阿密大学Jochen Reiser教授。

1.1.2 药物与试剂

保肾通络方饮片(生黄芪、熟地黄、菟丝子、鬼箭羽、刘寄奴、水蛭、丹参)由首都医科大学附属北京中医医院中药房提供。RPMI-1640无糖培养基(货号11879-020，美国Gibco公司)、RPMI-1640含糖培养基(货号11875-093，美国Gibco公司)、胎牛血清(货号C04001-500，以色列Biological Industries公司)、干扰素-γ(interferon-γ,INF-γ)(货号315-05-20，美国Pepro Tech公司)、PBS 缓冲液(货号KGB5001，凯基生物)、CCK-8试剂盒(货号CK04，日本同仁化学)、活性氧检测试剂盒(货号MAK145，美国Sigma公司)、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(货号C2006，碧云天公司)、鬼笔环肽-FITC(货号P5282，美国Sigma-Aldrich公司)、线粒体红色荧光探针Mito Tracker©Red CMXRos(货号8778P，美国Cell Signaling Technology公司)、Alexa Fluor 594驴抗兔IgG(货号A32754，美国Invitrogen公司)、足细胞裂孔膜蛋白nephrin抗体ab216341，美国Abcam公司)、自噬相关蛋白5(autophagy-related protein 5，ATG5)抗体(货号ab108327，美国Abcam公司)、ATG7抗体(货号ab52472，美国Abcam公司)、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗体(货号ab19289，美国Abcam公司)、GAPDH抗体(货号10494-1-AP，美国Proteintech公司)等。

33 ℃ CO2细胞培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，37 ℃ CO2细胞培养箱(日本SANYO公司)、荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)、普通荧光显微镜(德国ZEISS公司)、激光共聚焦显微镜(日本Leca公司)、Western blotting 化学发光仪(美国Bio-Rad公司)、全自动酶标仪 MK3(美国Thermo公司)、流式细胞仪(美国Beckman coulter公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 含药血清制备

选取雄性SPF级SD大鼠40只(动物伦理批件号:BUCM-4-2020121804-4173)，体质量为(180±20)g，数字表法随机分为保肾通络方组和空白对照组，分别用于制备含药血清及空白血清，每组20只。其中保肾通络方组按照20倍临床剂量进行灌胃，空白组给予等体积蒸馏水灌胃，连续灌胃7 d。末次灌胃结束后2 h，1%(质量分数)戊巴比妥钠按照40 mg/kg 剂量麻醉大鼠，腹主动脉取血，分离血清，56 ℃水浴30 min后无菌滤器过滤除菌，分装冻存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 足细胞培养与分组

MPC5于含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中传代，并于37 ℃、5%(体积分数) CO2的细胞培养箱内培养，待细胞到70%～80%融合时可用于实验。具体分组如下：正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+空白血清)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖+空白血清)、保肾通络方组(30 mmol/L葡萄糖+保肾通络方含药血清)，然后进行细胞收集或固定，用于以下实验，各组试验均重复3次。

1.2.3 CCK-8法检测足细胞活力

将MPC5以2 000个/孔接种至96孔板中，每孔100 μL，设置6个复孔，按上述分组分别培养48 h后加入10 μL/孔CCK-8反应液，于37 ℃孵育箱反应2 h，采用酶标仪检测波长为450nm的吸光度值并按照说明书计算细胞活力。

1.2.4 鬼笔环肽染色

我现在只好用性的方式来证明我的爱，证明我对她有强烈的进取心。而这一点恰恰成了她嘲笑我的地方。她甚至在我们做爱的间隙，也对我的真诚表示出怀疑。她是这样说的，你这么亢奋，是不是装的？要不就是吃了伟哥？我大声斥责说，我靠！你就这么埋汰我啊？我究竟哪点对不起你，让你这么瞧不起我？白丽筠斜吊起眼睛瞥向天花板说，你跟你的姓叶的女朋友，是不是也这么嗨？我想起跟叶霭玲的交媾，远没有这么多的激情，但我没有回答她。心想，你有什么权利过问我与叶霭玲的关系呢？要知道你自己曾经有过那么多的男人！

将MPC5以8 000个/孔接种到24孔板上，按上述方法分组培养48 h，吸弃培养基，PBS洗涤，4%(质量分数)多聚甲醛固定，0.2%(体积分数)TritonX-100透膜，3%(体积分数)驴血清封闭，鬼笔环肽-FITC 1 μg/mL染色，封片，避光4 ℃保存。荧光显微镜观察和拍摄具有代表性的图像。

1.2.5 免疫荧光

将MPC5以8 000个/孔接种到24孔板上，经上述方法分组处理48 h后，Mitotracker红色荧光标志物标记线粒体，绿色荧光标记自噬蛋白LC3-Ⅱ，共聚焦激光显微镜观察线粒体结构及LC3-Ⅱ与线粒体共标的表达情况。

1.2.6 流式细胞术

将MPC5以30 000个/孔接种于6孔板上，经上述方法分组处理48 h后，按照活性氧检测试剂盒及JC-1线粒体膜电位检测试剂盒说明书步骤操作，收集细胞进行流式细胞仪分析。

1.2.7 Western blotting法检测蛋白

将RIPA裂解液加入收集的足细胞中，冰上裂解30 min，离心后取上清，BCA法定量蛋白浓度。制备SDS-PAGE凝胶，将等量的蛋白加入孔槽中电泳，电泳结束后将分离的蛋白转移至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃摇床孵育过夜[LC3B(1∶2 000)、P62(1∶1 000)、ATG5(1∶2 000)、ATG7(1∶100 000)、Nephrin(1∶1 000)；GAPDH(1∶5 000)为内参]。洗膜，二抗摇床室温孵育1 h，ECL试剂暗室内胶片曝光，显影，Image J软件分析各条带的灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 保肾通络方含药血清对高糖条件下足细胞活力的影响

CCK-8法检测不同组别足细胞活力，采用不同高浓度葡萄糖(20～60 mmol/L)干预足细胞，结果表明，30 mmol/L高糖干预48 h足细胞活力明显降低(P<0.05，图1A)，与含10%(体积分数)胎牛血清培养基培养的足细胞比较，5%～12%的保肾通络方含药血清干预后足细胞活力差异无统计学意义(P>0.05，图1B)。而继续升高血清浓度，足细胞活力则显著下降。进一步实验结果显示，与正常组相比，高糖组足细胞活力显著降低，加入8%保肾通络方含药血清可明显恢复高糖条件下足细胞活力(P<0.01，图1C)。

图1 不同浓度葡萄糖及保肾通络方含药血清对足细胞活力的影响

2.2 保肾通络方含药血清对高糖诱导的足细胞氧化损伤的作用

鬼笔环肽染色结果显示，与正常组相比，高糖组足细胞骨架褶皱呈多边形，应力纤维束被破坏，保肾通络方含药血清能够恢复正常的细胞骨架(图2A)。流式细胞术检测各组足细胞ROS水平，结果显示，与正常组相比，高糖组足细胞ROS水平显著升高，保肾通络方含药血清可降低高糖刺激的ROS生成(P<0.01)(图2B,C)。Western blotting结果显示，与正常组相比，高糖组足细胞Nephrin蛋白表达显著降低(P<0.05)，而保肾通络方含药血清可部分恢复足细胞Nephrin蛋白的表达水平(P<0.05)(图2D)。

图2 保肾通络方含药血清对足细胞骨架及氧化损伤的影响

2.3 保肾通络方含药血清对高糖诱导的足细胞线粒体自噬的影响

Western blotting结果显示，与正常组相比，高糖组足细胞自噬相关蛋白ATG5、ATG7下调(P<0.01)，LC3Ⅱ/Ⅰ比值下降(P<0.05)，与高糖组相比，保肾通络方组ATG5、ATG7蛋白表达上调(P<0.01，P<0.05)，LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高(P<0.05)(图3A)。共聚焦显微镜显示各组足细胞线粒体与LC3B免疫荧光共标情况，与正常组相比，高糖组线粒体MitoTracker和自噬蛋白LC3共标减少；而保肾通络方含药血清干预可使足细胞线粒体与LC3B共标增多(图3B)。JC-1荧光探针进行足细胞染色，流式细胞术检测各组足细胞线粒体膜电位水平，红色荧光标记线粒体膜电位正常足细胞，绿色荧光标记为线粒体膜电位下降的足细胞，结果显示，与正常组相比，高糖组红色/绿色荧光标记的足细胞比值明显降低(P<0.01)；与高糖组相比，保肾通络方组红色/绿色荧光标记的足细胞比值显著升高(P<0.01)(图3C,D)。以上结果表明，保肾通络方含药血清改善高糖培养下足细胞线粒体自噬障碍并减轻其线粒体损伤。

图3 保肾通络方含药血清对足细胞线粒体自噬及线粒体膜电位的影响

3 讨论

线粒体是细胞能量代谢的枢纽，而作为能量需求最为旺盛的器官之一，肾脏是除心脏外线粒体含量最为丰富的器官。线粒体功能障碍在DKD足细胞损伤中发挥了至关重要的作用[10]，研究[11]表明，糖尿病小鼠足细胞存在明显线粒体损伤，长时间高糖刺激使足细胞线粒体呼吸链活性下降，线粒体DNA拷贝数明显降低，足细胞数量减少。在本研究中笔者同样发现高糖在导致足细胞损伤的同时，引起了足细胞线粒体功能障碍，主要表现为线粒体数目减少、线粒体膜电位受损。在线粒体中，主要依靠呼吸链复合物从还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADPH)/还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(reduced flavin adenine dinucleotide, FADH2)接受电子进行传递，并由复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ向膜间隙泵出H+从而形成线粒体膜电位，并由此与三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)合成酶相偶联，最终在ATP合成酶作用下使二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)磷酸化生成ATP，因此，线粒体膜电位的形成是正常氧化磷酸化反应的重要前提，在这一过程中，线粒体呼吸链也会有少量的电子漏出，生成少量ROS，作为细胞正常代谢产物，在生理情况下会被细胞内的抗氧化物质及时清除。在糖尿病或高血糖状态下，尽管代谢底物的增加产生更多的NADH/FADH2，但由于线粒体功能障碍导致电子不能正常传递而漏出，过量ROS不能被及时清除，从而造成氧化应激损伤[12]。高血糖导致线粒体生成过量ROS对其他细胞器造成氧化损伤的同时，也可对线粒体本身的脂类、蛋白质和核酸等造成损伤，导致线粒体功能障碍，从而进入氧化损伤的恶性循环状态[13-14]。因此，除直接针对ROS进行抗氧化治疗外，恢复线粒体功能，也可能是修复DKD足细胞损伤的重要靶点[15]。

线粒体自噬是通过自噬-溶酶体途径，选择性清除受损或不需要的线粒体，是细胞维持线粒体稳态极为重要的自我调节机制。当线粒体发生损伤时，可激活自噬清除异常线粒体以维持线粒体稳态，若病情进一步加重，受损线粒体过量积聚，线粒体自噬障碍导致受损的线粒体不能及时清除，最终造成足细胞受损[16]。LC3是自噬标记蛋白，参与自噬泡的生成[17]。当自噬激活时，LC3-Ⅰ脂质化形成LC3Ⅱ，LC3-Ⅱ与自噬体膜上的磷脂酰乙醇胺结合并定位在胞内自噬体膜上；与此同时，自噬相关蛋白12(autophagyrelated protein 12，ATG12)与ATG7作用后进而同ATG5发生共价结合，形成ATG5-ATG12复合物，该复合物再与ATG16、LC3Ⅱ结合形成更复杂的ATG5-ATG12-ATG16-LC3Ⅱ复合物，最终与自噬体膜相结合，包裹受损的线粒体，形成线粒体自噬体被溶酶体识别吞噬，启动线粒体降解程序，完成线粒体自噬过程[18]。研究[19]表明，持续的高血糖状态，会导致足细胞线粒体自噬能力明显降低，且抑制线粒体自噬，会加重糖尿病小鼠足细胞损伤。在本研究中笔者也发现高糖刺激下自噬相关蛋白ATG5、ATG7、LC3 Ⅱ/Ⅰ表达下降，LC3B与线粒体共标减少。

继承全国名老中医、首都国医名师张炳厚教授学术思想，本团队认为“肾失封藏，肾络闭阻”是DKD发病的核心病机，基于此，笔者以“益肾通络”立法，在张胜容教授经验方保肾系列方(保肾方、改良保肾方Ⅱ号)基础上进一步优化，增强通络作用，组方为保肾通络方。方中以黄芪补气益肾为君，熟地填补肾精为臣，二者合用益肾气，补肾精，鬼箭羽、刘寄奴、丹参、菟丝子为佐，鬼箭羽、刘寄奴、丹参合用活血通经、祛瘀生新，菟丝子味甘涩精固肾，味辛又可发散通经，使补而不滞，水蛭虫蚁入肾络为使，咸苦并行、破血利水。全方通涩共施，以通入脉，以涩固精，合以辛润通络、虫蚁通络，使瘀血得除，络脉得通而肾脏得补，精微得固，共奏“益肾涩精，活血通络”之功。本研究显示，保肾通络方含药血清可使高糖刺激的足细胞活力恢复、骨架结构改善，足细胞标志蛋白nephrin升高，ROS生成减少，说明保肾通络方含药血清能够减轻高糖诱导的足细胞氧化损伤。进一步研究表明，保肾通络方干预可恢复高糖诱导的足细胞线粒体膜电位，使自噬相关蛋白ATG5、ATG7表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高且LC3B与线粒体共定位增加，提示中药复方保肾通络方能够改善线粒体自噬障碍，减轻足细胞线粒体损伤。

综上所述，足细胞氧化损伤与线粒体功能障碍、线粒体自噬受损密切相关，保肾通络方可改善高糖培养下足细胞改善线粒体自噬障碍，清除受损线粒体，恢复线粒体功能，可能是保肾通络方改善足细胞氧化损伤的作用机制，但其具体的作用通路和靶点仍需要进一步深入探讨。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明王梦迪、赵文景：提出研究思路，设计研究方案；王梦迪、郭弋凡、庞彦余、刘羽飞：进行实验，采集、分析数据和绘制图表；王梦迪：论文撰写；赵文景：总体把关、审定论文。