共享外周循环对糖尿病肾病小鼠肾损伤的影响

黄 琪 周亦伦* 孙雪峰

(1.首都医科大学附属北京天坛医院肾内科，北京 100050；2.中国人民解放军总医院肾内科 肾脏疾病国家重点实验室，北京 100853)

糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)已经成为我国人群中慢性肾脏病的首位病因[1]，有效防治DKD不但是我国卫生经济的重大需求，也是世界范围的医疗难题。1990年至2010年间，美国糖尿病患者相关并发症呈现明显下降趋势，其中糖尿病引起的急性心肌梗死、高血糖危象、卒中及截肢发生率下降达50%以上；遗憾的是，糖尿病肾病的发生率变化最小，20年来几乎无明显下降[2]。

DKD是遗传与环境因素交互作用所致的复杂疾病，发病机制尚未完全阐明。强化胰岛素治疗可减少DKD发生进展；胰腺移植5～10年后DKD患者尿白蛋白、肾功能和肾组织病变都能恢复正常，提示代谢异常是DKD发生和进展的关键机制。但是仅仅30%～40%的糖尿病患者合并DKD，其他糖尿病患者尽管存在高血糖状态却不发生DKD，提示糖代谢异常并非DKD发生进展的唯一因素。但是，非糖代谢的代谢异常在DKD发生和进展中的研究不足，确切机制尚不明确；尚存在不同研究结果间差异性大，筛选出的代谢物质并非DKD特异而是广泛表达于所有终末期肾病的情况[3]。

连体动物模型通过建立两只动物间的微循环交通，实现连体动物间的血液细胞及可溶性因子的持续交换。该模型不但可以探讨一个生物体内环境改变是否能够引起疾病、衰老及表观遗传背景的变化，同时还可以探讨一个生物体循环因素的改变(如疾病、衰老、饮食、运动等)是否会导致另一个年轻健康生物体的机体状态发生相应变化。本课题组在前期研究[4]中发现，青年小鼠与老年小鼠连体后，老年小鼠肾脏衰老的相关指标明显下降；与健康青年小鼠共享外周循环的老年急性肾损伤(acute renal injury, AKI)小鼠，其肾功能、炎症、氧化应激等损伤指标明显低于未连体对照组[5]。

连体动物模型同样是DKD研究的理想模型。将野生小鼠分别与链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱导的不同DKD进展期的小鼠构建连体模型，通过连体动物间血液循环，野生小鼠胰腺分泌的胰岛素等代谢因子进入DKD小鼠体内调控物质代谢；DKD小鼠体内物质进入野生小鼠体内，利用野生小鼠的胰腺进行代谢调控，从而实现野生小鼠对DKD小鼠的外周循环支持。利用该创新动物模型，以野生小鼠为阴性对照，以STZ诱导的DKD小鼠为阳性对照，解析共享外周循环对DKD小鼠肾组织损伤的作用，以期形成DKD发生进展的代谢异常新理论。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理

C57BL/6J雄性小鼠由首都医科大学附属北京天坛医院动物中心提供，动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。所有实验过程均获得首都医科大学附属北京天坛医院动物保护和利用委员会审批(审批号：202001002)。小鼠饲养在温度(22±2)℃、湿度50%±5%的环境中，12 h∶12 h昼夜循环，自由进食水，采用随机数字法将小鼠随机分为3组，每组24只小鼠，各组处理如下。

(1)阳性对照组，即STZ诱导的糖尿病组：选择8周龄的C57BL/6J雄性小鼠，禁食12 h，STZ(美国Sigma公司)一次性腹腔注射50 mg/kg，连续注射5 d。完成STZ注射后3 d，测定空腹血糖，选择血糖高于16.7 mmol/L小鼠纳入后续试验。此后根据STZ注射后不同时间点细分为3组：①STZ注射后12周(DKD 12周,n=8)②STZ注射后20周(DKD 20周,n=8)③STZ注射后28周(DKD 28周,n=8)。

(2)阴性对照组：与阳性对照组处理类似，但将STZ更换为0.9%(质量分数)氯化钠注射液(以下简称生理盐水)注射8周龄C57BL/6J雄性野生型(wild type，WT)小鼠，同样注射后根据不同时间分为3组：①生理盐水注射后12周(WT 12周,n=8)②生理盐水注射后20周(WT 20周,n=8)③生理盐水注射后28周(WT 28周,n=8)。

(3)连体组，即STZ诱导的糖尿病小鼠与野生型小鼠连体组(parabiosis-DKD,para-DKD)：将8周龄C57BL/6J雄性小鼠分别与STZ注射后12、20及28周的DKD小鼠连体，3组分别为：①para-DKD 12周(n=8)②para-DKD 20周(n=8)③para-DKD 20周(n=8)。连体8周后处死动物，分别采集各组小鼠的血液、尿液和肾组织标本进行后续试验。

1.2 构建连体模型

切开小鼠皮肤和皮下组织，分离供体小鼠胸部肌肉袢，缝合至受体小鼠胸部肌肉，并缝合2 只小鼠皮下组织和皮肤。通过相互缝合肌肉和皮下组织粘连生成的微血管再通，形成小鼠间血细胞和可溶性因子相互交换的共享循环系统。具体手术步骤参照之前的实验过程[6]。

1.3 尿液、血液检测

尿液采用代谢笼收集，用ELISA试剂盒测定尿白蛋白及尿肌酐。麻醉造模后12、20及28周的小鼠后，采用内眦采血法采血，采用全自动生化分析仪(日本日立公司7150型)测定小鼠血清血糖、胰岛素、三酰甘油、总胆固醇。

1.4 组织病理

石蜡包埋的肾脏组织切片应用碘酸-雪夫(periodiz acid-Schiff，PAS)染色评价糖尿病肾病肾小球糖原沉积水平，进而明确糖尿病肾病肾小球硬化程度。Masson染色评估糖尿病肾病的纤维蛋白沉积，进而明确糖尿病肾病纤维化程度。

1.5 Western blotting法检测蛋白含量

肾脏冰冻组织块加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF为1∶100)100～300 μL，超声破碎仪(美国Coleparmer公司)65%功率破碎至组织溶解，冰浴30 min，4 ℃离心机12 000 r/min离心30 min后，取透明上清液即蛋白。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒(批号JK126465，美国Thermo Fisher公司) 测定蛋白浓度。向10%～15%(质量分数)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中加入60～100 μg总蛋白，再将蛋白转至硝酸纤维素膜上，1×酪蛋白于室温封闭1 h，分别加入以下抗体于4 ℃孵育过夜：Ⅰ型胶原蛋白(collagen type Ⅰ， ColⅠ)(英国Abcam公司，批号ab260043)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)(美国Cell Signaling Technology公司，批号3033)。再分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或抗小鼠IgG (美国Santa Cruz公司)，稀释浓度为1∶1 000。增强化学发光法测定免疫反应条带，用Quantity One软件(美国Bio-Rad公司) 对条带进行半定量分析。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 共享外周循环对DKD小鼠血糖及血脂影响

分别取不同时期阴性对照组、阳性对照组以及连体动物模型小鼠的血液进行血糖、胰岛素、三酰甘油及总胆固醇检测。血糖检测结果显示，与阴性对照组相比，阳性对照组小鼠在DKD 12周[(436.0±30.9)mg·dL-1vs(164.4±7.1)mg·dL-1]、DKD 20周[(510.3±32.5)mg·dL-1vs(170.2±4.9)mg·dL-1] 、DKD 28周[(508.7±31.6)mg·dL-1vs(168.4±8.3)mg·dL-1]血糖均明显升高；与野生小鼠共享外周循环的DKD小鼠血糖明显下降，介于阴性对照及阳性对照小鼠之间[DKD 12周：(260.6±15.9)mg·dL-1;DKD 20周：(278.6±18.5)mg·dL-1; DKD 28周:(269.5±16.2)mg·dL-1]，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。胰岛素、三酰甘油及总胆固醇的检测结果与血糖变化一致(表1)。

表1 3组小鼠在不同DKD时期血糖及血脂比较

2.2 共享血液循环对DKD小鼠肾功能影响

本文用尿白蛋白/肌酐(albumin-to-creatinine ratio，ACR)与阴性对照组相比，STZ诱导的糖尿病小鼠(阳性对照组)在DKD 20周时ACR开始增高，DKD 28周时进一步升高，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；而连体后拥有共享外周循环的小鼠DKD 20周ACR无明显升高(36.5±3.3vs55.4±3.2)，DKD 28周升高程度明显低于阳性对照组(50.4±3.9vs79.6±4.9)(表2)。

表2 3组小鼠在不同DKD时期尿白蛋白/肌酐比较

2.3 共享外周循环减轻DKD小鼠肾脏病理损伤

阳性对照组小鼠自DKD 20周开始，肾脏肾小球体积及系膜区面积明显增加；而连体模型提供健康外周循环的DKD 20周小鼠，其肾小球体积及系膜区面积均明显减低(图1)。肾小球、肾小管及肾间质纤维蛋白沉积情况与之相似，连体后的DKD 20周小鼠肾脏纤维化水平明显低于阳性对照组DKD小鼠(图1)。

图1 DKD 20 周各组小鼠肾脏病理损伤情况

2.4 共享外周循环减轻DKD小鼠肾脏纤维化

检测肾小球硬化及纤维化的相关标志物发现，与对照组小鼠相比，DKD 28周小鼠肾脏纤维化相关蛋白TGF-β1、ColⅠ的蛋白表达量明显升高，而连体模型提供了共享外周循环的DKD小鼠肾脏上述蛋白表达量明显低于阳性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图2。

图2 纤维化标志物Col I及TGF-β1在DKD 28周各组小鼠肾脏的表达

3 讨论

连体模型早在一百多年前就已建立，即通过外科血管吻合术把两只动物的循环系统连接起来从而完成外周循环的交换。目前连体动物模型在多个领域均有应用，如循环、认知、干细胞、生殖及内分泌[7-9]。近年来有研究[10]显示，利用连体动物模型提供外周循环可加快糖尿病小鼠皮肤愈合，也有学者[11]通过连体动物模型发现中枢神经系统来源的循环降糖因子。然而，连体动物模型在糖尿病肾病领域的研究较少，据此笔者建立野生型小鼠与DKD小鼠连体模型进行相关方面的研究。

在本研究中，STZ诱导的DKD小鼠随着疾病进展，在持续性高糖及胰岛素抵抗等因素作用下，在DKD 20周时出现肾小球体积增大、系膜基质累积、肾间质纤维化等肾组织损伤；而在持续的共享外周循环作用下，随着DKD小鼠体内血糖浓度下降、胰岛素敏感性升高，连体8周后其肾损伤明显减轻，且纤维化相关分子标志物蛋白表达明显减低。提示连体模型提供的持续共享体外循环可有效减缓DKD进展。

持续性高血糖和胰岛素抵抗是诱发炎症、氧化应激、组织损伤的重要因素，肾小球慢性炎症可导致肾脏结构异常及纤维化，进而导致肾功能丧失。此外，提高胰岛素敏感性可能对肾脏血管内皮细胞功能保护起重要作用[12]。在本项实验中，连体提供的共享外周循环可能通过降低血糖、调节胰岛素抵抗等方式减轻肾脏炎症、氧化应激，从而减轻肾损伤。此外，本课题组既往研究[4]显示，青年小鼠与老年小鼠连体后，老年小鼠肾组织自噬增强，炎症、氧化应激及纤维化指标明显下降，进一步利用细胞因子芯片对各组进行聚类分析，特异性地筛选出 6 种衰老相关的细胞因子，进一步应用筛选出的关键因子的基因修饰细胞和动物模型，明确解析了该关键因子的致病机制。同理，在本项研究中，可能存在某种(些)细胞因子通过共享循环途径，作用于DKD小鼠肾脏，减轻肾损伤，该假设正在后续开展的实验中进一步佐证。

脂代谢平衡对维持细胞的基本功能具有重要作用，为脂代谢异常参与了慢性肾小球疾病和肾小管间质性疾病的发生。脂代谢紊乱导致DKD发病的机制较为复杂，目前尚未完全明了。脂质可通过炎性反应、氧化应激、自噬、内质网应激和细胞凋亡等途径导致足细胞损伤、细胞外基质增加和巨噬细胞浸润[13-14]。脂肪酸与甘油酯化形成三酰甘油储存于脂肪细胞中，并通过脂蛋白运输入循环系统。DKD患者常伴有脂代谢紊乱，肾脏细胞内过量的游离脂肪酸及其代谢物(如脂肪酰辅酶A和神经酰胺)对肾小球内皮细胞和上皮细胞有直接损伤作用，也可加剧细胞损伤、炎性反应和纤维化的恶性循环。

胆固醇代谢异常也是DKD进展的重要原因之一。总胆固醇浓度升高是DKD 进展的危险因素之一，总胆固醇升高与大量蛋白尿之间存在相关性。DKD小鼠的肾脏皮质中有胆固醇的积累，DKD 患者的足细胞内也有胆固醇的沉积[15]。胆固醇沉积受到胆固醇摄取和合成增加，以及胆固醇流出或逆转运减少等多个过程的影响。在本项研究中，自DKD 12周至28周，血清三酰甘油及总胆固醇浓度逐渐升高，伴随ACR逐渐增多及肾组织损伤。相反，连体后的DKD小鼠，因存在持续性共享外周循环，其三酰甘油及总胆固醇浓度仅轻度升高，其DKD 28周时ACR浓度与阳性组DKD 20周持平。提示连体动物模型可能通过提供外周循环，调控DKD小鼠脂质代谢，最终减轻肾脏损伤。

总之，通过连体模型建立共享循环的方式，证实了共享外周循环可降低DKD小鼠的血糖浓度、增强其胰岛素敏感性、调节脂质代谢，进而减轻肾脏组织损害，改善肾脏纤维化，保护肾功能。其中哪些循环因子发挥关键作用及其信号转导机制，将在后续试验中进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明黄琪：提出研究思路，设计研究方案，进行试验，采集、分析数据，撰写论文。周亦伦：总体把关、审定论文。孙雪峰：提出研究思路，设计研究方案。