核周型抗中性粒细胞胞浆抗体对儿童系统性红斑狼疮的临床意义

何萍 沈佳 徐丹 王紫燕

苏州大学附属儿童医院检验科（江苏苏州 215003）

抗中性粒细胞胞浆抗体（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）是一组针对中性粒细胞胞浆颗粒中主要表达蛋白的自身抗体，通过间接免疫荧光可以区分ANCA 的不同模式，即细胞质模式、核周模式和不典型模式[1]。不同模式常对应不同的靶抗原，如髓过氧化物酶（MPO）与核周型ANCA（p-ANCA）相关，蛋白酶3（PR 3）与胞浆型ANCA（c-ANCA）相关。自身抗体，如抗双链DNA（dsDNA）抗体和抗可提取核抗原（ENA）抗体，以及补体活性的变化可反映系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）疾病活动或治疗效果[2]。ANCA主要与ANCA相关血管炎（ANCA-associated vasculitis，AAV）有关，对于具有临床特征的AAV患者，ANCA 阳性提供了较高的诊断价值（约95%的敏感性和90%的特异性）。许多SLE 患者ANCA可以阳性，尤其是p-ANCA。然而ANCA 对于儿童SLE 临床症状、疾病活动性和预后转归的预测作用尚不清楚。与成人发病的SLE 相比，儿童SLE 更具侵袭性，疾病活动性更高，诊断时症状更严重，肾脏、心血管和神经精神受累的发生率更高[3]。本研究主要分析p-ANCA 阳性对于儿童SLE 的其他自身抗体、免疫功能、肾功能以及肾脏病理结果的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2016年1月至2021年7月在苏州大学附属儿童医院就诊的SLE患儿的临床资料。研究对象纳入标准：①年龄1 个月至18 岁；②依据中华医学会风湿病学分会制订的《系统性红斑狼疮诊断及治疗指南》中的诊断标准[4]确诊为SLE；③完成血清ANCA 及相关实验室检查；④排除感染、肿瘤和其他结缔组织病。

SLE 患儿根据p-ANCA 检测结果分为p-ANCA阳性组和p-ANCA阴性组。

本研究通过苏州大学附属儿童医院医学伦理委员会审核批准（批准文号：2015LW005），并获得家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 收集患儿年龄、性别，自身抗体包括抗双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）抗体、抗史密斯（Smith，Sm）抗体、抗干燥综合征抗原A（Sjögren's syndrome antigen A，SSA）抗体、抗硬皮病-70（scleroderma-70，Scl-70）抗体、抗着丝点蛋白B（centromere protein B，CENP-B）抗体、抗干燥综合征抗原B（Sjögren's syndrome antigen B，SSB）抗体、抗组氨酰tRNA 合成酶（Jo-1）抗体、抗U1-n核糖核蛋白抗体/史密斯抗体（抗U 1-nRNP/Sm 抗体）、抗组蛋白抗体、抗核糖核蛋白（anti-ribosome ribonucleoprotein，rRNP）抗体、抗核小体抗体、抗Ro-52 抗体、抗多发性肌炎/硬皮病（polymyositis-scleroderma，PM-Scl）抗体、抗增殖细胞核抗原抗体（proliferating-cell nuclear antigen antibody，PCNA）、抗线粒体抗体-M 2 型（antimitochondrial antibody-M2，AMA-M2）抗体，及免疫功能和肾功能相关指标、肾脏病理检查结果。

1.2.2 检测指标及方法 研究对象入院时抽取9～12 mL静脉血，以离心力3 000×g离心15 min后，分离血清。抗核抗体（antinuclear antibodies，ANA）、抗dsDNA 抗体及ANCA采用间接免疫荧光法（IIF）在欧蒙全自动荧光酶联免疫分析一体机Sprinter XL检测，EUROPattern 全自动荧光显微镜判读结果。通过三基质ANCA判读顺序排除ANA的干扰。第一张基质粒细胞（乙醇固定）判断ANCA 阴性或阳性以及cANCA或pANCA。第二张基质粒细胞（甲醛固定）判断pANCA甲醛敏感或抗性。第三张为Hep-2与粒细胞混合包被基质，①当仅存在ANCA时，可见粒细胞荧光着色，而Hep-2未见荧光或仅有微弱荧光，在同一视野下粒细胞荧光强度明显强于相邻的Hep-2细胞；②当同时存在ANA和ANCA时可见Hep-2与粒细胞混合包被基质上Hep-2和粒细胞均有荧光着色，且同一视野下粒细胞的荧光强度明显强于相邻的Hep-2 细胞；③当只存在ANA 时，Hep-2 与粒细胞混合包被基质上可以观察到所有细胞核均有荧光着色，Hep-2和粒细胞上的荧光强度相似。ANCA相关特异性靶抗原包括过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、蛋白酶 3（proteinase 3，PR3）和抗肾小球基底膜（glomemlar basement membrane，GBM）抗体检测采用免疫印迹法在欧蒙EUROLineMaster Plus自动免疫印迹AN 仪上测定。所有标本均严格按照操作规程进行检测。体液免疫相关项目包括补体（C3、C4）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM），采用免疫比浊法用西门子ADVIA 2400 全自动生化分析仪检测。尿肌酐（UCr）、尿IgG（UIgG）、α 1 微球蛋白（α 1-MG）、β 1 微球蛋白（β 1-MG）、尿转铁蛋白（U-TRF）、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）和尿微量白蛋白（UMA）采用免疫投射比浊法在日立全自动生化分析仪7180 上检测。尿蛋白、尿隐血在尿液分析仪AUTION MAX UrilyzerAuto上检测。尿隐血红细胞≥50个/μL和尿蛋白＞50 mg/dL为阳性。ANA滴度≥1:320为阳性，dsDNA≥1:32为阳性。免疫印迹法测定抗核抗体谱及ANCA 特异性抗体结果，灰度值15～20为阳性。

1.3 统计学分析

采用 SPSS 17.0 统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布的以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的以中位数（P25～P75）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

共纳入191 例SLE 患儿，女160 例、男31 例，平均年龄（12.0±3.5）岁。pANCA 阳性组81 例（42.4%），男13例、女68例，平均年龄（12.7±3.2）岁；pANCA 阴性组110 例，男14 例、女96 例，平均年龄（11.4±3.6）岁。两组间性别（χ2=0.42，P=0.515）、年龄（t=1.84，P=0.070）差异无统计学意义。

81例pANCA阳性患儿中，pANCA（甲醛抗性）阳性26例（32.1%），pANCA（甲醛敏感）阳性55例（67.9%）；抗髓过氧化物酶（MPO）抗体阳性29例，占pANCA 阳性患儿35.8%。抗肾小球基底膜抗体和抗MPO抗体同时阳性1例。

2.2 pANCA阳性和阴性组一般实验室及自身抗体指标比较

与pANCA 阴性组相比，pANCA 阳性组血沉较高，Hb 较低，自身抗体中ANA、抗dsDNA 抗体、抗SSA抗体、抗CENP-B抗体、抗组蛋白抗体、抗rRNP抗体、抗核小体抗体以及抗Ro-52 抗体阳性率均较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 pANCA阳性和阴性组一般实验室及自身抗体指标比较

2.3 pANCA阳性和阴性组免疫功能及肾功能比较

与pANCA 阴性组相比，pANCA 阳性组C 3 和C4较低，UCr、UIgG/UCr、α1-MG/UCr、β1-MG/UCr、NAG/UCr、UMA/UCr 较高，尿隐血和尿蛋白阳性比例较高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 pANCA阳性和阴性患儿免疫功能和肾功能相关指标比较

2.4 pANCA阳性和阴性组肾脏病理结果比较

共112 例SLE 患儿进行肾穿刺活检，其中pANCA阴性患儿63例，pANCA阳性49例。光镜下肾脏病理改变提示，pANCA阳性患儿有3例新月体形成。与pANCA 阴性组相比，pANCA 阳性组系膜增生比例较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。免疫荧光标记检查提示，与pANCA阴性组相比，pANCA阳性组肾小球系膜和毛细血管袢IgG、IgM、IgA、C 1 q 和C 3 沉积比例较高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 pANCA阳性和阴性组肾脏病理结果比较[n (%)]

3 讨论

儿童SLE是一种较少见但能引起全身各器官系统严重损害的自身免疫性疾病。和普通人群相比，儿童SLE的总体标准化死亡率（SMR）更高，特别是＜18 岁的住院患者，SMR（6.5）大约为正常人（所有年龄段SMR为2.2）的3倍[5]。发病年龄越小（＜5岁）患儿症状越不典型，并发症和不良预后发生率越高[6]。由于个体间显著的异质性，儿童SLE 的诊断复杂，治疗更为困难。

本研究SLE患儿中pANCA阳性率为 42.4%，相关靶抗原以MPO为主，阳性率占pANCA的35.8%，与成人报道一致[7]。原因可能为：①与pANCA 甲醛抗性的主要相关靶抗原为MPO，而pANCA 甲醛敏感的相关靶抗原有乳铁蛋白、弹性蛋白酶、组织蛋白酶和溶菌酶及其他未知抗原[8]，需要更多的研究来发现这些未知的抗原；②pANCA 检测及其相关靶抗原检测的方法学不同使其检测的阳性率有差异；③MPO 与p-ANCA 相关主要发生在AAV 患者中，而在ANCA的其他相关疾病这样的相关性不明显。

pANCA 在SLE 及其并发症中的作用及其机制仍不明确。狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）患者体内可能通过促进中性粒细胞脱颗粒和激活中性粒细胞，增加细胞表面 MPO 的表达，从而促进ANCA形成[9]。中性粒细胞可能在不同形式的细胞死亡过程中释放中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs），NETs参与多种促进自身反应和组织损伤的自身免疫疾病的发病机制，包括SLE 和ANCA相关血管炎。NETs上的自身抗体导致更多的C1q沉积，导致无效的净降解和促炎症反应的恶性循环。同时，抗dsDNA抗体和抗ENA抗体阳性患者的净降解效率受损，这与活动性SLE 患者疾病活动和肾脏受累有关[10]。

本研究发现，和pANCA 阴性组相比，pANCA阳性SLE 患儿Hb 降低并伴有血沉增快，表明pANCA可以反映SLE 活动情况。而Hb 降低可能与ANCA相关的血尿有关[11]。ANA 滴度和抗dsDNA 抗体阳性率在pANCA阳性组明显高于pANCA阴性组，与既往的成人研究一致[7，12]。ENA的相关指标在大多数情况下随着ANA 各种不同核型和滴度的变化而改变。因此ENA相关指标在一般情况下也能反映疾病进展和活动趋势。抗dsDNA抗体被广泛认为是用于诊断SLE 和评估疾病活动性的一项重要指标，同时也可以促使LN的发生。抗dsDNA抗体和ANA的致病性主要由免疫复合物形成引起，免疫复合物通过组织沉积或诱导细胞因子释放引起全身性免疫细胞紊乱。目前筛查策略建议ANA 和抗dsDNA 抗体同时检测，以识别所谓的“活动性、自身抗体阳性SLE”患者。由于疾病的自然史或治疗的影响，ANA反应会随着时间的推移而减少。对于已经确诊SLE的患者，定期ANA血清学检测可阐明与发病机制和疾病状态相关的变化[13]。

本研究SLE 患儿pANCA 阳性组补体C 3 和C 4水平低于pANCA阴性组，与国外研究结果一致[14]。但也有文献报道，SLE患者C3和C4在pANCA阳性组和阴性组间无明显统计学差异[9]。这可能因为研究对象的年龄不同，同时也提示pANCA在儿童SLE中的作用不同于成人。国内文献也提及补体下降在临床上可作为SLE 和疾病进展的重要诊断线索，同时也是免疫功能紊乱的指标[15]；补体C 3 持续降低也是SLE肾脏损害的预测指标[16]。可能是由于脱氧核糖核酸酶-1 (deoxyribonuclease-1，DNase-1）抑制剂和NETs 抗体的存在阻止了DNase-1 进入NETs，DNase-1功能失效及NETs降解受损与肾脏受累、疾病活动性以及血液中C3和C4水平低有关。

pANCA对肾功能的影响尚无定论。有研究发现p-ANCA与LN相关[10]。也有研究报道在LN患儿中，ANCA阳性与血肌酐、肾小球滤过率、血尿、尿蛋白等肾损伤指标无关，但与肾脏病理改变有关[17]。本研究pANCA 阳性SLE 患儿比阴性患儿更容易发生系膜增生，而且p-ANCA 阳性组肾功能相关指标均高于阴性组，提示pANCA会加重肾功能和肾脏病理的损伤。不同研究结论的差异可能与SLE患者的年龄差异、疾病进展时期不同有关。

本研究儿童SLE 样本较少，由于临床病例资料不全，只收集肾脏病理的光镜结果，并未对肾脏的病理资料进行分型，因此无法对pANCA与不同类型肾脏病理进行相关性分析。儿童SLE的临床表现各不相同，pANCA可能与儿童SLE的疾病活动性和肾脏损害密切相关。