苗药验方对膝骨关节炎家兔血清β-catenin、TNF-α 水平的影响

付钰 李宝杰 陶陶 古丽玲 罗昌禄 梅建 夏景富

膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是一种慢性退行性关节疾病,主要临床表现为关节疼痛、功能障碍,从而影响人们的生活质量［1］。贵州地处云贵高原,气候阴冷潮湿,是膝骨关节炎的高发地区,长期以来,苗族人民在与关节炎抗争的过程中发现,苗医药治疗膝骨关节炎疗效可靠,便于操作,成本低廉且安全性高。苗药熏蒸疗法属于苗医传统外治法的一种,是通过对皮部的温热、药物、机械等刺激而发挥治疗作用,属于经皮给药的范畴。离子导入技术是现代经皮给药技术中研发最早的一种技术,能促使皮肤电阻下降,改善局部血液循环,通过其电场对药物离子产生定向的推动力来提高药物的经皮渗透率［2］。本研究用木瓜蛋白酶制备家兔膝骨关节炎模型,观察苗药验方熏蒸疗法与离子导入疗法对膝骨关节炎家兔血清中β-catenin、TNF-α 水平的影响,探索苗药治疗膝骨关节炎的效应机制,为苗药的推广应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与分组 新西兰大白兔36 只,雌雄各半,体重2.0～2.5 kg,SPF级繁殖饲料饲养,灭菌饮用水饲养,饲养温度20～26℃,湿度40%～70%。

1.1.2 主要仪器及试剂 定向透药离子导入仪(FB-312012002,长沙海凭医疗设备有限公司)；数显恒温水浴锅(HH-2,常州天瑞仪器有限公司)；全自动酶标仪(WD-2102B,北京市六一仪器厂)；木瓜蛋白酶(CAS#9001-73-4,上海源叶生物科技有限公司)；兔TNF-α 试剂盒(ED-72292,厦门仑昌硕生物科技有限公司)；兔β-catenin 剂盒(ED-73872,厦门仑昌硕生物科技有限公司)。

1.1.3 苗药验方［3］透骨香(杜鹃花科)30 g、白龙须(八角枫科)6 g、土一枝蒿(菊科)10 g、五香血藤(五味子科)10 g、大血藤(木通科)10 g、艾纳香(菊科)30 g、艾叶(菊科)15 g 等(贵州贵阳同济堂药店)。苗药制备方法：将以上诸药用蒸馏水浸泡40 min 后煎煮,煎煮成浓度为68%～70%的药液备用。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 适应性喂养7 d 后,随机分为正常对照组、模型组、苗药熏蒸组、苗药离子导入组,每组9 只。将4%木瓜蛋白酶溶液(4%木瓜蛋白酶的配制：称取0.168 g 的木瓜蛋白酶,加入4.2 ml 的生理盐水完全溶解)0.3 ml 注入模型组、苗药熏蒸组、苗药离子导入组的家兔右膝关节腔内［4］,每隔3 d 注射1 次,连续注射3 次,获得稳定的膝骨关节炎模型后造模完成。

1.2.2 治疗方法 苗药熏蒸组：造模成功后,每日将苗药置于自制恒温熏洗箱中,待蒸气温度达到39～40℃对家兔进行熏蒸,20 min/次；苗药离子导入组：造模成功后,用两片医用无菌药垫充分浸湿苗药液5 ml,包裹在家兔右膝关节,外包连接定向透药离子导入仪的电极板,外面用绷带胶布固定,定向透药离子导入仪持续治疗20 min,治疗时红外强度设置为1,能量强度设置为5。以上治疗1 次/d,共治疗20 d,治疗时以与空气混合的5%异氟烷轻度吸入性麻醉。正常对照组与模型组：造模成功后每日抓拿及轻度麻醉,但不实施治疗。

1.2.3 行为学观察 分别于治疗第10、20 天用改良Lequesne MG 的膝关节级别评估方法［5］对四组家兔右膝关节局部反应、步态改变、关节活动范围及肿胀程度等情况进行评估。

1.2.4 取血与血清的制备 造模成功后第21 天,四组家兔均在无菌条件下心脏采血。所取血液放4℃冰箱静置过夜,离心(3000 r/min)20 min,取上清,将同组动物血清混合,经0.22 μm 抽滤除菌后,56℃灭活30 min,分装,于-80℃冰箱保存,备用。

1.2.5 ELISA 方法检测家兔血清β-catenin、TNF-α水平 取备用血清,ELISA 方法检测四组家兔血清中β-catenin、TNF-α 含量,具体操作按试剂盒说明进行；用酶标仪在450 nm 测定光密度值(OD 值),以浓度作为横坐标,吸光度值作为纵坐标,绘制标准曲线,根据标本的OD 值在坐标上找出对应的浓度值,单位用pg/ml表示。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐性时用LSD 法,方差不齐时用Dunnett T3 法,组内比较采用配对t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组家兔改良Lequesne MG 评分比较 模型组、苗药熏蒸组、苗药离子导入组家兔第10、20 天的改良Lequesne MG 评分均高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01)；苗药熏蒸组、苗药离子导入组家兔第10、20 天的改良Lequesne MG 评分均低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.01)；苗药熏蒸组与苗药离子导入组家兔第10、20 天的改良Lequesne MG 评分组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。正常对照组、模型组家兔第20 天的改良Lequesne MG 评分与本组第10 天比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；苗药熏蒸组、苗药离子导入组家兔第20 天的改良Lequesne MG 评分均低于本组第10 天,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 四组家兔改良Lequesne MG 评分比较(±s,分)

表1 四组家兔改良Lequesne MG 评分比较(±s,分)

注：与正常对照组比较,aP＜0.01；与模型组比较,bP＜0.01；与本组第10 天比较,cP＜0.05

2.2 四组家兔血清β-catenin、TNF-α 水平比较模型组、苗药熏蒸组、苗药离子导入组家兔血清β-catenin、TNF-α 水平均高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01)；苗药熏蒸组家兔血清β-catenin、TNF-α 水平均低于模型组,苗药离子导入组家兔血清β-catenin 水平低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.01)；苗药离子导入组家兔血清TNF-α 水平与模型组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；苗药离子导入组家兔血清β-catenin 水平与苗药熏蒸组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；苗药离子导入组家兔血清TNF-α 水平高于苗药熏蒸组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 四组家兔血清β-catenin、TNF-α 水平比较(±s,pg/ml)

表2 四组家兔血清β-catenin、TNF-α 水平比较(±s,pg/ml)

注：与正常对照组比较,aP＜0.01；与模型组比较,bP＜0.01；与苗药熏蒸组比较,cP＜0.05

3 讨论

膝骨关节炎是一种以膝关节软骨退行性改变为病理性特征的慢性进行性骨关节病,主要表现为关节疼痛、僵直、畸形和关节功能严重障碍［6］。随着我国社会人口的老龄化,膝骨关节炎因其在老龄人中的高发病率与危害性成为人类健康的主要问题。因此,探讨膝骨关节炎发病的机制以及寻找一种安全、有效、方便的防治方法,是广大学者面临的重大课题。

膝骨关节炎的病因及发病机制尚不完全清楚,目前认为其发病中心环节是关节软骨的退行性改变,而Wnt/β-catenin 信号通路在软骨细胞的生长发育、增殖、分化、迁移、调亡及稳态维持方面起着重要作用。β-catenin 是经典Wnt 信号通路的核心分子,上游分子传递的信号均需通过β-catenin 才能发挥作用。有研究发现膝骨关节炎患者软骨组织中β-catenin的mRNA 表达水平均明显增加,但在未受损伤软骨中的表达没有升高［7］,而Wnt/β-catenin 的过度表达以及β-catenin 的降解减少,都会引起转录水平升高进而导致软骨细胞的细胞外基质合成停止［8］。膝骨关节炎关节组织、滑液中均存在促炎细胞因子,如白细胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α 等［9］。其中TNF-α 是膝骨关节炎病理改变过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的最重要细胞因子,能诱导滑膜组织中β-catenin 等因子的分泌,从而促进滑膜炎症的进一步发展［10］,由此说明TNF-α 可能通过Wnt/β-catenin 通路驱动膝骨关节炎炎症反应和诱导软骨退变。本实验结果显示,与正常对照组相比,模型组β-catenin、TNF-α 水平显著升高,与上述研究结果一致,β-catenin 和TNF-α 均参与了膝骨关节炎的产生和发展。

膝骨关节炎在苗医中当属“风湿类疾病”中的冷骨风、冷肉风、湿热风范畴［11］。近几年的临床研究表明苗药外治法治疗膝骨关节炎有明确的临床疗效,可以减轻或改善患者关节疼痛度、关节疼痛、晨僵、屈伸不利的症状,降低血清炎性指标血沉(ESR)、C 反应蛋白(CRP)及中医证候积分情况［12-14］,可以对膝骨关节炎模型大鼠的痛行为及膝关节活动有明显的改善作用,并通过促进关节软骨bcl-2 的表达和抑制p53、Bax 的表达,从而抑制膝骨关节炎软骨细胞的凋亡,改善软骨的病变［15,16］。

本研究选用的苗药验方是贵州苗族人民在长期与膝骨关节炎抗争的过程中发现总结的苗药熏蒸常用方,有很高的实用价值,但受各种条件的限制,其治疗的机制研究相对滞后。因此,作者在该苗药验方熏蒸治疗广泛的临床应用基础上,运用了离子导入法这种新型的经皮给药方法,观察苗药验方对膝骨关节炎模型家兔血清中β-catenin 和TNF-α 的影响,探讨苗药防治骨关节炎软骨退变的机制。本研究发现该苗药验方经皮给药能够改善膝骨关节炎家兔模型改良Lequesne MG 评分,降低膝骨关节炎家兔模型血清中Wnt/β-catenin 通路上的核心分子β-catenin、促炎细胞因子TNF-α 的水平。初步证实了苗药验方经皮给药能够通过调控Wnt/β-catenin 通路,减轻膝骨关节炎炎症反应,从而改善膝骨关节炎症状,延缓软骨细胞的损伤,本研究为苗药验方经皮给药的进一步临床推广应用提供了实验依据。