中药金莲花质量标准的建立与优化

吴 磊,陆 超

(1. 南京中医药大学附属医院 药学部，江苏 南京 210029； 2. 南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210046)

金莲花为毛茛科植物金莲花(TrolliichinensisFlos)的干燥花，具有清热降火、滋阴解毒等功效[1-4]。始载于晚清吴其所著《植物实名图考》，后作为药用被清代赵学敏所著《本草纲目拾遗》收录，据称：金莲花出自五台山，又名旱地莲，一名金芙蓉，色深黄，味苦，无毒，性寒，可治口疮喉肿，浮热牙宣，耳痛目痛[5]。金莲花曾在2003年被选为预防严重急性呼吸道综合征(SARS)疾病中的复合处方药物之一，近年来，以金莲花为君药的中药制剂越来越多，如：《上海市中药材标准》1994年版、《黑龙江省中药材标准》2001年版和《山西省中药材标准》2014年版等地方中药材标准都收载了金莲花，但均缺少对其药效成分进行定性和定量检测方法的介绍。2015年版《中国药典》目前也尚未收载，严重影响了金莲花临床使用的安全性和有效性。因此，对金莲花质量标准的完善将非常必要。

金莲花的主要成分为黄酮类物质，是其抗菌、抗病毒、抗炎镇痛、解热和抗氧化的重要活性成分[6]。其中黄酮类糖苷，包括牡荆素和荭草苷，占到金莲花总黄酮类成分的2/3，具有很强的抗菌与抗病毒活性[7-8]。本研究选择了牡荆素和荭草苷作为对照，建立了金莲花的薄层鉴别(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)为检测方法，同时对多个产地的金莲花进行分析，为其质量标准的研究提供依据，后期将对其药理作用进行进一步的深入研究，以期使其在抗击新冠肺炎的战役中发挥一定的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters-2695型高效液相色谱仪、Waters-2998型二极管阵列检测器，美国Waters公司; BP-211D型万分之一天平，德国赛多利斯公司；KQ-1000E型医用超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；CAMAG(TLC XISUALIZER2)型薄层色谱成像系统，WD-9413A型凝胶成像分析仪，北京市六一仪器厂。

1.2 试剂与药材

荭草苷对照品(批号：111777-201302)和金莲花对照药材(批号：121089-201204)，中国食品药品检定研究院; 牡荆素对照品(批号：160324，含量≥98%),南京宁歧医药科技有限公司; 甲醇和乙腈均为色谱纯，乙酸乙酯和磷酸均为分析纯，水为超纯水；聚酰胺薄膜(批号：20160906)，上海国药集团化学试剂有限公司；8个不同来源的金莲花样品由江苏省药学会提供，详见表1，经南京中医药大学附属医院药学部鉴定为正品，按所规定的炮制方法和要求，进行了净制加工，去除了杂质，得到符合要求的金莲花饮片。

表1 金莲花样品信息

1.3 实验方法

1.3.1 显微鉴别方法

对金莲花粉末的显微特征进行观察，增订粉末显微鉴别。分别取1～8号样品制片，观察其显微特征。

1.3.2 薄层鉴别方法

取各批金莲花样品粉末0.25 g，加体积分数70%乙醇溶液25 mL，超声30 min，过滤后蒸干，残渣加水20 mL，正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，加入1 mL甲醇溶解，制备供试品溶液。精密称定牡荆素和荭草苷对照品，加甲醇制成对照品溶液; 对照药材溶液同对照品溶液方法进行制备。

吸取上述对照药材、供试品和对照品溶液各5 μL，于聚酰胺薄膜板上点样，展开剂使用二氯甲烷-甲醇-丙酮-冰乙酸(体积比为4∶ 2∶ 3∶ 3)，体积分数1%AlCl3乙醇试液进行显色，烘箱内加热(105 ℃)至斑点清晰，于365 nm紫外光灯下检视。

1.3.3 含量测定方法

1.3.3.1 对照品溶液的制备

精密称取荭草苷和牡荆素对照品 11.59和10.49 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得对照品储备液; 分别精密吸取上述储备液各 1 mL，摇匀，即得混合对照品溶液。

1.3.3.2 供试品溶液的制备

精密称定供试品0.3 g，加入体积分数80%乙醇溶液50 mL至锥形瓶中，称质量，水浴锅上回流2 h，静置至室温，补质量，滤过沉淀，精密量取续滤液 25 mL，水浴锅上蒸干，残渣加水 25 mL溶解，30 mL乙酸乙酯萃取2次,合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试样品。

1.3.3.3 色谱条件

色谱柱：HederaC18 ODS-2型(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相：乙腈(A)和体积分数0.4%磷酸(B)溶液，体积比为17∶ 83，流速为1.0 mL/min，检测波长为340 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，理论塔板数按荭草苷峰计算，应不低于 6 000。

图1 金莲花粉末显微特征Fig.1 Microscopic characteristics of the powder of Trollii chinensis Flos

1.3.3.4 含量测定

精密称取不同产地的金莲花药材粉末约 0.3 g，按照供试品溶液制备方法，计算各样品中荭草苷及牡荆素的含量。

1.3.3.5 精密度试验

取混合对照品溶液连续进样6次，计算峰面积积分值，根据荭草苷、牡荆素的相对标准偏差(RSD)值计算精密度。

1.3.3.6 稳定性试验

取同一供试品溶液静置至室温，于 0、1、2、4、6、8、10、24和48 h分别进样 10 μL，测定荭草苷、牡荆素的峰面积，计算荭草苷、牡荆素峰面积的 RSD 值。

1.3.3.7 重复性试验

取1号金莲花样品 0.3 g，精密称定平行样品6 份，制备供试品溶液，计算荭草苷、牡荆素含量平均值与RSD值。

1.3.3.8 回收率试验

取已知含量的1号金莲花样品粉末0.15 g，精密称定6份,置于具塞锥形瓶中，加入荭草苷、牡荆素混合对照品溶液适量，制备供试品溶液，进样10 μL，测定，计算荭草苷及牡荆素的平均回收率。

2 结果与讨论

2.1 显微鉴别结果

参考文献[9-10]，分别取1～8号样品制片，对金莲花粉末显微特征进行观察，结果见图1。由图1可知：本品花粉粒呈类球形，无色至淡黄色，直径20～30 μm,外壁光滑，有的可见3孔沟。花粉囊内壁细胞碎块淡黄色，完整细胞呈类长方形，长40～70 μm，宽约10 μm，细胞壁呈连珠状增厚。 花瓣表皮细胞淡黄色，呈乳突状或非腺毛状隆起，直径15～25 μm，有的胞腔内含有红棕色或黄棕色颗粒状物。花冠表皮气孔为不定式，椭圆形，直径25～35 μm，副卫细胞4～5个，垂周壁弯曲，螺纹导管多成束存在，直径5～9 μm。

2.2 薄层色谱鉴别结果

对正丁醇、二氯甲烷-甲醇-丙酮-冰乙酸(体积比为4∶ 2∶ 3∶ 3)2种不同展开条件进行考察，结果表明：二氯甲烷-甲醇-丙酮-冰乙酸展开效果好，斑点清晰，分离度好，比移值(Rf)适宜。对正丁醇和二氯甲烷-甲醇-丙酮-冰乙酸2种不同提取溶剂进行考察，结果表明：正丁醇萃取的供试品溶液，主斑点更清晰，所以选取正丁醇萃取的供试品为提取样品。

通过对8批金莲花药材进行薄层检查可知，来源不同的金莲花样品薄层色谱无明显差异，供试品色谱在与牡荆素、荭草苷对照品相应位置上均显出相同颜色的绿色荧光斑点(图2)。

注：1为荭草苷对照品；2为牡荆素对照品； 3为金莲花对照药材；4～11为金莲花1～8号样品图2 金莲花薄层色谱Fig.2 TLC of Trollii chinensis Flos

2.3 含量测定结果

2.3.1 系统适用性试验结果

参考文献[11-13]，按1.3.3.3项下的液相色谱条件，得到金莲花的HPLC色谱图(图3)，由图3可知：金莲花样品分离效果好，荭草苷、牡荆素与其他成分均达到基线分离。

图3 金莲花HPLC色谱Fig.3 HPLC chromatograms of Trollii chinensis Flos

2.3.2 线性关系考察结果

精密称取荭草苷、牡荆素对照品11.59、10.49 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解，静置至室温，甲醇定容。吸取荭草苷和牡荆素溶液各1 mL制备混合对照品母液。 再用甲醇稀释至1 mL分别含荭草苷0.231 8、0.115 9、0.058 0、0.029 0、0.014 5、0.007 2 mg，牡荆素0.209 8、0.104 9、0.052 5、0.026 2、0.013 1、0.006 6 mg的混合对照品溶液。

取上述溶液各10 μL 进样进行线性回归，得到荭草苷、牡荆素的回归方程(n=6)分别为荭草苷Y=25 491X-126.87(r=0.999 8)，牡荆素Y=17 729X-90.507(r=0.999 7)。结果表明：荭草苷质量浓度在0.0 072～0.2 318 mg/mL范围内，牡荆素质量浓度在0.0 066～0.2 098 mg/mL范围内，与峰面积积分值具有良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验结果

荭草苷、牡荆素的RSD值分别为0.50%和0.92%，表明精密度良好。

2.3.4 稳定性试验结果

荭草苷、牡荆素峰面积的 RSD值分别为1. 83%和2.21%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.3.5 重复性试验结果

荭草苷、牡荆素含量平均值分别为0.491%和0.192%，RSD值分别为1.33%和1.53%，表明重复性良好。

2.3.6 回收率试验结果

荭草苷及牡荆素的回收率试验结果见表2。由表2可知：荭草苷及牡荆素平均回收率分别为95.00%与90.27% ，RSD值分别为2.19%与2.88%，该方法的准确性良好，符合含量测定的要求。

表2 加样回收率试验考察结果(n=6)

2.3.7 荭草苷及牡荆素含量测定结果

荭草苷及牡荆素含量测定结果见表3。由表3可知：8批次的金莲花样品中，荭草苷含量的均值为0.686%，牡荆素含量的均值为0.231%，且8批样品中荭草苷含量差异较大，最高可达0.933%，最低为0.463%；牡荆素含量最高可达0.283%,最低为0.192%。采收时间也许是影响荭草苷含量差异大的主要原因。

表3 荭草苷及牡荆素含量测定结果(n=3)

3 结论

1)在标准的设置方面，《上海市中药材标准》1994年版、《黑龙江省中药材标准》2001年版和《山西省中药材标准》2014年版等地方中药材标准收载了金莲花，但均缺少对其药效成分进行定性和定量检测的介绍，本次金莲花的质量标准研究的内容已被收载至2020版《江苏省中药饮片炮制规范》，弥补了无薄层鉴别和含量测定的不足，提高了其临床使用的安全性和有效性。

2)荭草苷是中药金莲花中重要的活性成分，具有保护心血管、抗衰老、抗肿瘤、抗炎、镇痛、抗病毒、抗菌等药理活性，目前的研究发现：不同批次的金莲花中荭草苷含量差异较大，来自相同产地金莲花的荭草苷含量亦有高低，说明产地并不是主要的影响因素，采收时间也许是影响荭草苷含量的最主要原因，因此，有待进一步增加样本量，对不同时间采收的金莲花进行研究，从而更好地控制饮片质量。