复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮发酵品质及瘤胃降解率的影响

王挺，宋磊，2，王旭哲，马春晖，杜保军，张凡凡*

（1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000；2.天康生物股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830000；3.新疆维吾尔自治区畜牧总站，新疆 乌鲁木齐 830000）

畜牧业是解决国计民生的重要产业之一，在保障食品安全、发展农村经济、增进牧民创收等方面发挥着重要作用［1］。然而，近年来我国日益紧迫的饲草料问题已经无法满足畜牧业高质量发展需求，如何拓宽新型饲料资源途径，已成为目前亟待解决的问题。苜蓿（Medicago sativa）是新疆地区富有的饲草资源［2］，目前总种植面积超25万hm2，由于其含水量大，水溶性碳水化合物（water-soluble carbohydrate，WSC）含量低，难以调制优质青贮［3］，因此目前主要以干草加工为主，而在调制干草过程中落叶损失大、营养物质流失快，大幅度降低了苜蓿资源的有效利用率。番茄（Lycopersicon esculentum）是新疆地区的优势产业，番茄皮渣是番茄酱加工后产生的皮籽混合物，出渣率是鲜重的3%［4］，2019年新疆番茄总产量超1457万t［2］，每年产出至少43万t番茄皮渣，由于其极易氧化酸败，如不加以利用，不仅是对生产资源的巨大浪费，还会造成严重的环境污染。现有研究表明，番茄皮渣中粗蛋白（crude protein，CP）及粗脂肪（ether extract，EE）含量较高，富含多种矿物质元素（钾、磷）及番茄红素［5］，因其较高的营养价值且低廉的成本，诸多研究不断尝试将番茄皮渣添加至动物日粮中，以期在满足动物需求的同时最大限度地提高资源利用率。有研究证实，番茄皮渣添加至动物日粮可显著提高褐牛干物质采食量［6］，增加肉兔胴体收益［7］，提高羔羊生产系统的可持续性［8］，降低瘤胃内挥发性脂肪酸浓度［9］，提高奶牛有机质消化率［10］，降低养殖成本。然而番茄皮渣代替日粮，用量较小，无法充分发挥其饲用价值。

青贮是目前储存新鲜饲草的主要技术手段，但新鲜番茄皮渣含水量及WSC含量过高，单独青贮难以获得优良发酵品质（潮湿的发酵环境及高含量WSC易滋生腐败菌），因此其与梨（Pyrusspp）渣、玉米（Zea mays）秸秆、高粱（Sorghum bicolor）等混合青贮［11-13］，可弥补各自发酵条件的缺陷，达到提质增效的目的。在实际生产中，由于混合青贮原料的特性差异，混合比例、发酵体系营养组成对青贮品质影响较大，所以采用番茄皮渣与半干苜蓿混合青贮，理论上可有效补充苜蓿WSC含量的不足，调节含水量，并为发酵体系提供足够的底物；但番茄皮渣和苜蓿表面附着的乳酸菌较少（＜1×105CFU·g-1），无法满足发酵条件，因此接种外源菌剂是调控青贮发酵成功的关键因素［14］。纵观以往研究发现，接种同型乳酸菌可显著提高干物质回收率，提升发酵品质［15］，然而同型发酵乳酸菌在发酵前期产生的乙酸（acetic acid，AA）含量较少，无法抑制腐败菌的繁殖；异型发酵乳酸菌产乳酸（lactic acid，LA）能力虽然较差，但其产生的乙酸可有效抑制霉菌的生长，提高青贮的有氧稳定性。因此，同、异型发酵乳酸菌往往复合接种，以有效保存原料营养物质，减缓青贮营养损失［16］，但目前对混合青贮的影响研究较少。鉴于此，本研究探究接种复合乳酸菌植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）+布氏乳杆菌（Lactobacillus brucei）对番茄皮渣与苜蓿混合青贮营养品质、发酵品质和瘤胃降解率的影响，为提高资源利用率，拓宽本地区饲草料资源提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以新疆生产建设兵团第八师石河子市石河子大学牧草试验站（44°22′N，88°30′E，海拔420 m）种植的WL343苜蓿为试验材料，种植时间为2019年3月20日，条播，株距为15 cm，滴灌，生育期采用常规田间管理，定期除杂。收割时间为2019年9月20日（第3茬），收割后阴干将水分控制在60%左右后粉碎至2～3 cm的长度。番茄皮渣购自新疆泰昆饲料有限责任公司（新疆维吾尔自治区石河子市北泉镇），购回检测黄曲霉毒素（6.22 μg·kg-1）和黄曲霉毒素B1（1.51 μg·kg-1）含量均未超过国家限量标准（饲料卫生标准GB 13078-2017）。试验材料营养品质概况见表1。

表1 番茄皮渣与苜蓿原料营养品质概况（干物质基础）Table 1 Material nutrition parameters of tomato pomace and alfalfa（dry matter basis，%）

1.2 试验设计

试验采用真空袋法调制混合青贮（密度为550 kg·m-3），设计10个处理，其中5个处理不接种复合乳酸菌，混合比例（质量比）为：番茄皮渣:苜蓿=3:7（T1），4:6（T2），5:5（T3），6:4（T4），7:3（T5），干物质含量依次为：32.73%、30.64%、24.28%、22.61%、19.75%；另外5个处理在各混合青贮比例基础上均匀加入复合乳酸菌（布氏乳杆菌、植物乳杆菌，比例为1:1，1×106CFU·g-1），即分别为JT1、JT2、JT3、JT4、JT5。每组5个重复，每袋2 kg，实验室环境下（23～30℃）发酵60 d，60 d后开袋评定感官品质，测定营养品质、发酵品质、瘤胃降解率。

瘤胃降解采用瘤胃瘘管尼龙袋法［17］。选用3只体重相近体型相似［（50.00±2.50）kg］生长状况良好的哈萨克羊，安装永久性瘤胃瘘管，正常饲喂一周（苜蓿干草及配合饲料）。试验前采用番茄皮渣和苜蓿混合青贮预饲一周［每只羊每天0.2 kg精料（精料成分为玉米52%、麸皮24%、豆粕17%、尿素1.5%、食盐1%、碳酸氢钙2.5%、接种剂2%），混合青贮1.8 kg］，自由饮水。试验开始后将各处理样品再次干燥（65℃）至恒定并粉碎过筛（0.425 mm），准确称取3.00 g样品放入尼龙袋中（孔径40～50 μum，尺寸6 cm×9 cm），每只羊均做3次平行，于晨饲前（8：00）进行投放，设置1个时间点（24 h），到达相应时间后将尼龙袋取出迅速洗净，65℃烘干至恒定待测。另取3只尼龙袋放入3.00 g样品，不投入瘤胃中，经自来水反复冲洗后于65℃烘干至恒重，用于计算失重。

1.3 测定指标及方法

感官评定按照文献［18］，主要观察色泽、气味和质地。

营养指标的测定包含：干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、水溶性碳水化合物。采用烘干法测定DM含量，采用凯氏定氮法测定CP含量，采用范式纤维洗涤法（Van Soest）测定NDF、ADF含量，采用蒽酮-硫酸比色法测定WSC含量（前处理：精确称取0.2000 g样品放入15 mL离心管中，加入适量蒸馏水。置于100℃沸水浴洗涤30 min后取出，于低速离心机中离心5 min，将洗涤液转移至100 mL容量瓶中，重复洗涤3次后，定容至100 mL以备比色。）。均使用国标法测定［19］。

发酵品质的测定包含：pH、氨态氮（ammonia nitrogen，NH3-N）、乳酸、乙酸、丙酸（propionic acid，PA）、丁酸（butyric acid，BA）含量。采用酸度计测定pH值（前处理：精确称取20.00 g青贮待测样品置于180 mL去离子水中，于4℃冰箱中静置24 h后立即测定），采用苯酚-次氯酸钠比色法［20］测定NH3-N含量，采用高效液相色谱法［21］测定LA、AA、PA、BA的含量。

瘤胃降解率主要测定干物质降解率（dry matter degradation rate，DMD）、中性洗涤纤维降解率（neutral detergent fiber degradation rate，NDFD）、酸性洗涤纤维降解率（acid detergent fiber degradation rate，ADFD）。瘤胃降解结束后将尼龙袋取出洗净，采用烘干法计算DMD，将瘤胃降解残渣粉碎后，采用范式纤维洗涤法（Van Soest）测定NDFD及ADFD［19］。

1.4 数据处理

使用Excel 2019对所得数据进行整理，使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）检验10个处理间差异水平，多重比较使用Duncan法。使用Origin 2017软件进行双因素方差分析（Two-way ANOVA）检验接种复合乳酸菌及不同青贮混合比例及其交互作用对混合青贮的影响水平。

各处理混合青贮瘤胃降解率计算方法如下［22］：

式中：Dx为待测样品某成分的瘤胃降解率（%），MA为待测样品某成分含量（g），MB为过瘤胃残留物中某成分含量（g）。

以各处理混合青贮的DM、WSC、CP、LA、24 h DMD、24 h NDFD、24 h ADFD为正向指标，NDF、ADF、pH、AA、PA、BA和NH3-N/TN为负向指标得出各指标的隶属度，从而计算各混合青贮处理的总隶属度，以总隶属度的数值大小为依据对各混合青贮处理的综合价值进行排序（总隶属度数值越大，综合价值越高）。计算方法如下［23］：

式中：Ux正为各混合青贮处理中某一正向指标的隶属度，X为该指标的检测结果，Xmin为各混合青贮处理中该指标的最小值，Xmax为各混合青贮处理中该指标的最大值，Ux负为某一负向指标的隶属度，Ux总为各混合青贮处理的总隶属度，即各混合青贮处理所有正向指标的隶属度与所有负向指标的隶属度之和。

2 结果与分析

2.1 复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮感官品质的影响

结果表明（表2），接种复合乳酸菌可改善番茄皮渣与苜蓿混合青贮的气味及质地。除T5及JT5处理为橙色以外，其他处理均为黄绿色。T5处理为丁酸气味，JT5处理为轻微丁酸气味，其他处理均为乳酸气味。T1及JT1、T2及JT2、T3及JT3处理酸味浓郁，T4及JT4、T5及JT5处理酸味中等。T1及JT1、T2及JT2处理质地松散不粘手，无霉变，T3及JT3、T4及JT4、JT5处理轻微 粘手，无霉 变，T5处理 发 黏结块，霉 变。T1及JT1、T2及JT2处 理优等，T3及JT3、T4及JT4处理良好，JT5处理一般，T5处理差。

表2 复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮感官品质的影响Table 2 Effect of compound Lactobacillus on sensory quality of tomato pomace and alfalfa mixed storage

2.2 复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮营养品质及发酵品质的影响

结果表明（表3），接种复合乳酸菌显著提升了番茄皮渣与苜蓿混合青贮的DM、CP、LA、AA（P＜0.05），显著降低了WSC、NDF、ADF、pH、PA、BA、NH3-N/TN（P＜0.05）。不同青贮混合比例对番茄皮渣与苜蓿混合青贮的营养品质及发酵品质有显著影响（P＜0.05），T2、JT2处理的DM、CP含量显著高于其他处理（P＜0.05）；T2处理的WSC含量显著高于其他处理（P＜0.05）；JT2处理的NDF、ADF含量显著低于其他处理（P＜0.05）；JT1、JT2处理的pH显著低于其他处理（P＜0.05）；JT1、JT2处理的LA含量均显著高于其他处理（P＜0.05）；T1、T2的AA含量显著低于其他各处理（P＜0.05）；JT1、JT2的PA、BA含量及NH3-N/TN均显著低于其他处理（P＜0.05）。接种复合乳酸菌与不同青贮混合比例的交互作用对混合青贮的营养品质及发酵品质均有极显著影响（P＜0.01）。

表3 复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮营养品质及发酵品质的影响Table 3 Effects of compound Lactobacillus on nutritional quality and fermentation quality of tomato pomace and alfalfa mixed storage

2.3 复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮瘤胃降解率的影响

结果表明（表4），瘤胃降解24 h时，接种复合乳酸菌显著提升了番茄皮渣与苜蓿混合青贮的DMD、NDFD、ADFD（P＜0.05）。不同青贮混合比例对番茄皮渣与苜蓿混合青贮的瘤胃降解率有显著影响（P＜0.05），JT1和JT2处理的DMD、NDFD显著高于其他处理（P＜0.05），JT2的ADFD显著高于其他处理（P＜0.05）。接种复合乳酸菌与不同青贮混合比例的交互作用对番茄皮渣与苜蓿混合青贮的DMD、NDFD、ADFD均有极显著影响（P＜0.01）。

表4 复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮瘤胃降解率的影响Table 4 Effect of compound Lactobacillus on rumen degradation rate of tomato pomace and alfalfa mixed storage（%DM）

2.4 复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮效果影响的综合价值评定及排序

将各混合青贮的15项核心指标进行隶属函数分析，结果表明（表5），JT2为最优混合青贮，即在番茄皮渣添加量为40%（番茄皮渣:苜蓿=4:6，干物质含量30.64%）的混合青贮中接种复合乳酸菌，混合青贮的综合价值最高；各混合青贮综合价值排序为：JT2＞JT1＞T2＞T1＞JT3＞T3＞JT4＞JT5＞T4＞T5。

表5 复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮效果影响的综合价值评定及排序Table 5 Comprehensive value evaluation and ranking of the effects of compound Lactobacillus on tomato pomace and alfalfa mixed storage

3 讨论

3.1 复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮感官品质的影响

青贮的颜色、气味、质地是影响其适口性的关键因素。本研究中，番茄皮渣添加量为30%～40%，番茄皮渣与苜蓿混合青贮的感官综合评定优等，说明适宜的原料比例是控制青贮发酵成功的重要因素。此外，T5处理有丁酸气味，质地发黏结块霉变，感官综合评定差，这可能是由于混合青贮体系水分过高（80.25%），远高于青贮发酵

的适宜水分含量（65%～70%），潮湿的发酵环境容易滋生各类腐败菌，消耗混合青贮体系内的营养物质，因此在今后番茄皮渣混合青贮调制中需严格控制含水量［24］。接种复合乳酸菌仅对70%番茄皮渣添加量的混合青贮感官品质有影响，对其他比例的混合青贮的感官品质无明显影响，可能是由于混合青贮体系本身的水分及原料比例较为适宜，即可达到正常发酵，致使复合乳酸菌的增益价值无法从感官评定中体现出来，因此还需进一步分析混合青贮的发酵品质及瘤胃降解率，从而明确复合乳酸菌的影响。

3.2 复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮营养品质及发酵品质的影响

营养品质是衡量青贮饲料饲用价值的主要指标［25］。本研究中，接种复合乳酸菌可显著提高混合青贮的营养品质，当番茄皮渣添加量达到40%时有助于青贮发酵结束时干物质的回收，这可能是由于发酵结束后较高的DM含量可抑制大肠杆菌（Escherichia coli）等有害微生物生长从而有效保存营养物质［26-28］。此外，针对CP含量的分析同样表明，接种复合乳酸菌可显著提升混合青贮体系的CP含量，这可能是由于高水平的外源乳酸菌能够充分抑制好氧腐败菌的活动，阻止蛋白质被分解，从而有效保留混合青贮体系中的CP［29］。WSC含量是控制青贮发酵成功的基础［30］。本研究中，发酵结束后混合青贮WSC含量在番茄皮渣添加量达到40%时达到最高，这说明在该添加量下WSC在发酵结束后能得到最大保留。当番茄皮渣的添加量大于40%，高水平的WSC被混合青贮体系中的腐败菌利用，竞争性抑制乳酸菌的活动，阻碍混合青贮正常发酵［31］。此外，本研究发现，接种复合乳酸菌会降低混合青贮体系内的WSC含量，可能是由于乳酸菌数量的上升，增加了混合青贮体系中WSC的消耗。本研究中，各处理混合青贮的NDF、ADF含量经发酵后均有所下降，当番茄皮渣添加量为30%时效果最为显著（P＜0.05），这可能是由于布氏乳杆菌产生的阿魏酸酯酶能破坏纤维结构，从而降低纤维素的含量，这与前人研究结果一致［32］。

青贮发酵是一个复杂的动态体系，伴随着各类物质的转化和积累，青贮体系内pH和LA含量是评价发酵品质好坏的重要指标［33］。本研究中，接种复合乳酸菌可显著提升混合青贮体系的发酵品质，这是由于混合青贮自身附着的乳酸菌数量较低，大量外源乳酸菌的接种有助于抑制杂菌繁殖，进而减少了营养物质的流失。番茄皮渣添加量为30%～40%时，混合青贮中LA含量较高，pH较低，这是由于混合体系内的营养结构为乳酸菌发酵提供最适环境，LA能够迅速降低混合青贮体系的pH，使乳酸菌成为主导青贮发酵的优势菌群，因此适宜原料比例及含水量既是控制青贮发酵成功的基础，也是保障乳酸菌高效繁殖的条件［14］。同时，AA含量显著低于其他处理（P＜0.05），且在优质青贮的AA含量标准以内，AA主要是植物乳杆菌的发酵产物，高水平的AA在发酵前期虽不利于pH下降，但是在发酵后期，适宜的AA含量能有效抑制霉菌繁殖，提升混合青贮体系的有氧稳定性［15］。BA、NH3-N/TN可直接反映青贮体系中蛋白质消耗程度，对其分析也表明，当番茄皮渣添加量为30%～40%，混合青贮体系的BA含量、NH3-N/TN能够满足优质青贮的含量标准，而当番茄皮渣添加量不断上升，混合青贮体系的含水量逐渐增加，为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）的活动创造了充足条件，消耗大量CP及WSC的同时，分解青贮体系中的LA阻碍发酵进程。此外，大量BA聚集，导致混合青贮呈臭脂肪味，大幅降低混合青贮适口性［34］。

3.3 复合乳酸菌对番茄皮渣与苜蓿混合青贮瘤胃降解率的影响

瘤胃降解率是评价反刍动物对饲料消化特性的重要指标。DMD是影响反刍动物干物质采食量的重要因素，NDFD和ADFD是用于衡量结构性碳水化合物分解程度的关键指标，主要与饲料纤维组成，瘤胃微生物种类相关［35-36］。本研究中，瘤胃降解24 h后，当番茄皮渣添加量为30%～40%，接种复合乳酸菌的混合青贮DMD、NDFD和ADFD较高，这是由于适宜含量的干物质和粗纤维可有效刺激瘤胃蠕动，提升动物采食量，这与以往的研究结果一致［37］；当番茄皮渣添加量高于40%后，DMD、NDFD和ADFD呈下降趋势，这可能是由于饲料中NDF含量越高，木质素含量越高，瘤胃微生物降解木质素的能力较低，木质素在瘤胃中滞留，阻碍动物唾液分泌，导致动物采食量下降［38］。此外，本研究发现接种复合乳酸菌可显著提高混合青贮的DMD、NDFD和ADFD（P＜0.05），这可能是由于乳酸菌可以破坏植物细胞壁结构，降低了细胞壁对瘤胃微生物的抗性从而提高混合青贮体系内不能溶解但最终可降解部分的含量［39］，因此在今后青贮饲料的调制中，可通过接种一定剂量的复合乳酸菌改善青贮品质。

4 结论

1）布氏乳杆菌与植物乳杆菌（比例为1:1，1×106CFU·g-1）复合接种至番茄皮渣与苜蓿混合青贮，可显著改善混合青贮的营养品质、发酵品质及瘤胃降解率。

2）在番茄皮渣添加量为40%（番茄皮渣:苜蓿=4:6，干物质含量为30.64%）的混合青贮中接种复合乳酸菌最具推广意义。